本发明涉及生物，尤其是涉及一种冻存脐带血nk细胞的培养方法。
背景技术：
1、现有技术方案对于用于nk细胞扩增的单个核细胞通常采用ficoll或淋巴细胞分离液分离获得，然而该方法存在以下问题：
2、首先，一份脐带血中nk细胞的数量有限，脐带血冻存后nk细胞活率降低导致nk细胞数量进一步减少；其次，冻存脐带血分离单个核细胞会出现nk细胞回收率低、红细胞残留多等问题；另外，相对于新鲜脐带血nk细胞，冻存脐带血nk细胞激活扩增前期增殖较为缓慢。
3、以上问题极大的限制了nk细胞的最终产量。
4、有鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种冻存脐带血nk细胞的培养方法，以解决上述问题。
2、第一方面，本发明提供了一种冻存脐带血nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
3、将复苏后的冻存脐带血去除冻存液后依次进行激活培养和扩增培养，获得nk细胞；
4、所述激活培养的培养基主要由动物细胞培养基a和添加在动物细胞培养基a中的人ab血清、重组人il-2细胞因子、重组人il-15细胞因子、重组人il-21细胞因子、chroman1、emricasan、trans-isrib和polyamine solution组成；所述人ab血清的加入量为动物细胞培养基a体积的2％-10％；所述重组人il-2细胞因子的终浓度为200-1000iu/ml；所述重组人il-15细胞因子的终浓度为20-60ng/ml；所述重组人il-21细胞因子的终浓度为20-60ng/ml；所述chroman 1的终浓度为20-80nm；所述emricasan的终浓度为2-8um；所述trans-isrib的终浓度为0.2-1um；所述polyamine solution的终浓度为2-8ug/ml；
5、所述动物细胞培养基a包括gmp scgm培养基、nkbasalmedium培养基或x-vivotm-15培养基。
6、作为进一步技术方案，所述激活培养的时间为4-6天。
7、作为进一步技术方案，激活培养过程中，激活培养2-3天后，补充激活培养的培养基。
8、作为进一步技术方案，所述扩增培养的培养基主要由动物细胞培养基b和添加在动物细胞培养基b中的人ab血清、重组人il-2细胞因子和重组人il-15细胞因子组成；所述人ab血清的加入量为动物细胞培养基b体积的2％-10％；所述重组人il-2细胞因子的终浓度为200-1000iu/ml；所述重组人il-15细胞因子的终浓度为20-60ng/ml；
9、所述动物细胞培养基b包括gmp scgm培养基、nkbasalmedium培养基或x-vivotm-15培养基。
10、作为进一步技术方案，扩增培养过程中，每隔1-3天补充扩增培养的培养基。
11、作为进一步技术方案，扩增培养过程中，维持细胞密度为0.8×106-2.5×106/ml。
12、作为进一步技术方案，复苏后的冻存脐带血去除冻存液后，于重组人抗cd16单抗包被的培养容器中依次进行激活培养和扩增培养。
13、作为进一步技术方案，复苏冻存脐带血的方法包括：
14、将冻存脐带血水浴加热至融化，然后与复苏液混合，获得复苏的冻存脐带血。
15、作为进一步技术方案，冻存脐带血中冻存液的去除方法包括：
16、将复苏后的冻存脐带血离心去上清，然后进行清洗，完成对冻存脐带血中冻存液的去除。
17、作为进一步技术方案，所述清洗的清洗液包括生理盐水。
18、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
19、1.本发明将复苏后的脐带血去掉冻存液后直接进行nk细胞的激活和扩增，而不经过常规的单个核细胞分离过程，简化了操作过程，提高了冻存脐带血单个核细胞和nk细胞的回收率，而对nk细胞的体外扩增能力和杀伤活性没有影响，因此，本发明可以显著提高一份冻存脐带血体外扩增nk细胞的最终产量。
20、2.本发明通过在激活培养的培养基中添加小分子组合cept(chroman1、emricasan、trans-isrib和polyamine solution)，能够显著提高冻存脐带血nk细胞扩增倍数和nk细胞纯度。
1.一种冻存脐带血nk细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述激活培养的时间为4-6天。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，激活培养过程中，激活培养2-3天后，补充激活培养的培养基。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述扩增培养的培养基主要由动物细胞培养基b和添加在动物细胞培养基b中的人ab血清、重组人il-2细胞因子和重组人il-15细胞因子组成；所述人ab血清的加入量为动物细胞培养基b体积的2％-10％；所述重组人il-2细胞因子的终浓度为200-1000iu/ml；所述重组人il-15细胞因子的终浓度为20-60ng/ml；
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，扩增培养过程中，每隔1-3天补充扩增培养的培养基。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，扩增培养过程中，维持细胞密度为0.8×106-2.5×106/ml。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，复苏后的冻存脐带血去除冻存液后，于重组人抗cd16单抗包被的培养容器中依次进行激活培养和扩增培养。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，复苏冻存脐带血的方法包括：
9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，冻存脐带血中冻存液的去除方法包括：
10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述清洗的清洗液包括生理盐水。
