本发明涉及基因工程，具体涉及一种透明质酸水解酶、其基因及其工程菌和生产方法。
背景技术：
1、透明质酸酶(hyaluronidases，简称haase)是一种广泛分布、能够降解透明质酸(ha)的酶的总称，是一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶。透明质酸为组织基质中具有限制水分及其它细胞外物质扩散作用的成分，透明质酸酶在人体中能暂时降低细胞间质的粘性，促使皮下输液、局部积贮的渗出液或血液加快扩散而利于吸收，为一种重要的药物扩散剂。临床用作药物渗透剂，促进药物的吸收，促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散。
2、根据透明质酸的作用机理，将haase分为三种类型：(a)内酰胺-β-n-乙酰-d-氨基葡糖苷酶：该酶属于水解酶，将高分子量底物(ha)以内切的方式，作用于β-1，4糖苷键进行水解，降解后得到的终产物主要为四糖，来自于膜翅目(hymenoptera)毒液和哺乳动物精子等动物来源的透明质酸酶均属于此类，与后面两种透明质酸酶不同的是，这一种不仅作用于ha，还作用于硫酸软骨素，该酶也是首先被产业化应用的酶。(b)β-葡糖苷酸酶：来源于水蛭和钩虫，属于水解酶，通过内切作用方式，作用于β-1，3糖苷键，降解后得到的终产物为四糖，且该酶为特异性降解ha。(c)透明质酸裂解酶(hyaluronate lyase，简称hl)：多数是以细菌为代表的，还包括真菌和病毒来源的一组酶，通过β-消除机制的n-乙酰己糖胺酶，作用于β-1，4糖苷键，在c-4和c-5之间引入不饱和键。与前两种haase不同，hl的最终产物是二糖。不同菌属来源的hl，在底物特异性上表现有所不同。
3、cn114350639b在实施例中将7种不同动物毒液来源的透明质酸水解酶基因导入到工程菌中进行表达，结果只有山大齿猛蚁来源的重组透明质酸水解酶具有水解活性，证明了动物来源的透明质酸水解酶基因导入到工程菌后不一定具有水解活性。因此，虽然动物中存在多种编码透明质酸水解酶的基因，但是构建成工程菌并成功表达出具有水解活性的酶具有偶然性，而本技术人无意中发现重组表达的热带爪蟾透明质酸酶具有水解活性，并且通过序列突变，使得活性相较于野生型有巨大的提升，此外构建的工程菌可以进行高效表达。
技术实现思路
1、为了得到一种高催化活性的透明质酸水解酶，本发明提供了一种透明质酸水解酶，包含如seq id no.11所示的氨基酸序列。
2、本领域技术人员可以了解的是，seq id no.11所示的氨基酸序列为透明质酸水解酶发挥水解透明质酸活性的核心功能序列。
3、本发明提供了另外一种透明质酸水解酶，包含如seq id no.11所示的氨基酸序列和纯化标签。
4、seq id no.11所示的氨基酸序列，通过基因工程经过改造后得到。本领域技术人员可为了方便后续的纯化，从而引入纯化标签(纯化蛋白或标签蛋白)。
5、在本领域技术人员获知seq id no.11所示的氨基酸序列后，可依据底盘细胞的不同，合理设计对应的基因、表达载体(重组载体)、工程细胞(工程菌)。
6、优选地，包含如seq id no.2所示的氨基酸序列。
7、本发明还提供了一种透明质酸水解酶前体，包含所述的透明质酸水解酶和信号肽。
8、优选地，包含如seq id no.14所示的序列。
9、本发明还提供了一种基因，用于表达所述的透明质酸水解酶或其前体。
10、本发明还提供了一种基因，包含表达透明质酸水解酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如seq id no.1所示，或者如seq id no.8～10任一一个核苷酸序列所示，或者如seqid no.12所示，或者如seq id no.13所示，或者如seq id no.15所示。
11、本发明还提供了一种重组载体，包含上述的基因。
12、优选地，所述载体的框架为ppic9质粒
13、本发明还提供了一种工程细胞，包含权利要求6所述的基因，或包含权利要求7所述的基因，或包含权利要求8所述的载体。
14、本发明中的工程细胞(工程菌)指通过基因工程手段构建的工作细胞，用于产生经过设计的蛋白质(例如酶)，工程细胞可以由以下底盘细胞构建得到：包括但不限于诸如大肠杆菌(e.coli)、链霉菌(streptomyces)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)等细菌细胞；酵母细胞；真菌细胞，诸如巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)等；昆虫细胞，诸如果蝇、斜纹夜蛾sf9(spodoptera sf9)细胞等；动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(cho)、sp2/0(小鼠骨髓瘤)、人淋巴母细胞、cos、nso(小鼠骨髓瘤)、293t、弓形黑色素瘤细胞、ht-1080、幼仓鼠肾细胞(bhk)、人类胚胎肾细胞(hek)、perc.6(人类视网膜细胞)等；或植物细胞。
15、优选地，使用的底盘细胞选自毕赤酵母或大肠杆菌。
16、本发明还提供了一种透明质酸水解酶的应用，将所述的透明质酸水解酶或其前体或其基因或其表达载体或其工程细胞，用于水解透明质酸。
17、本发明还提供了一种构建工程细胞的方法，将基因或重组载体导入到底盘细胞中；所述基因是上述的基因；所述重组载体是上述的载体。
18、优选地，在所述方法中，所述底盘细胞选自毕赤酵母或大肠杆菌。
19、优选地，所述毕赤酵母为毕赤酵母km71h或毕赤酵母gs115。
20、本发明还提供了一种生产透明质酸水解酶的方法，包括用所述的工程细胞发酵得到。
21、优选地，发酵方法包括甘油控制。
22、优选地，控制甘油残留量≥2％。
23、优选地，发酵方法包括温度控制。
24、优选地，发酵温度不超过35℃，或者不超过34℃，或者不超过33℃，或者不超过32℃，或者不超过31℃。
25、本文中，“信号肽”意指存在于大多数新合成蛋白质的n-末端的短肽，这些蛋白质预定要进入分泌途径。其也可以称为信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽。信号肽通常通过信号肽酶从蛋白质切割下来。本发明中带有信号肽水解酶在分泌出细胞外后，信号肽部分随即被信号肽酶切除。
26、“透明质酸水解酶前体”意指连接有信号肽的透明质酸水解酶，具体到本发明，该前体由工程菌分泌产生后，由工程菌进一步切除信号肽后产生透明质酸水解酶。
27、信号肽与透明质酸水解酶可以是直接连接的，也可以通过可切割的连接肽连接。
28、优选地，信号肽与透明质酸水解酶直接连接时，信号肽中含有可别切割的部分。
29、优选地，透明质酸水解酶前体上的信号肽经过切割被去除后，残留在透明质酸水解酶上的残基，基本不会影响透明质酸水解酶的活性。
30、对于残留在透明质酸水解酶上的氨基酸残基，一个具体的例子为，工程菌内形成含seq id no.11所示序列的透明质酸水解酶前体，该前体的信号肽切除后形成seq idno.2所示的氨基酸序列，该序列与seq id no.11相比，在n端多出氨基酸残基“le”。
31、“标签蛋白”或“纯化蛋白”或“纯化标签”意指可以与特定的底物结合的一类蛋白分子。该蛋白的作用在于，在纯化时，与可识别该蛋白的底物结合，从而起到纯化水解酶的作用。
32、本文中的透明质酸水解酶可以包含标签蛋白，纯化后，所述水解酶上的标签蛋白，是否被切割并不影响水解酶的活性。出于简化工艺，降低生产成本的目的，所述水解酶上的标签蛋白在制备中通常不进行切割。
33、优选地，所述的标签蛋白选自本领域技术人员已知的标签蛋白或者经过计算机程序设计的标签蛋白，所述的标签蛋白能够与已知底物特异结合。
34、进一步优选地，所述的标签蛋白选自但不限于以下蛋白：谷胱甘肽s－转移酶(gsts)、c-myc、几丁质结合结构域、麦芽糖结合蛋白(mbp)、sumo异源亲和部分、单克隆抗体或蛋白a、链霉亲和素结合蛋白(sbp)、纤维素结合结构域、钙调蛋白结合肽、s标签、strep标签ii、fla、蛋白a、蛋白g、组氨酸亲和标签(hat)、多聚组氨酸。
35、优选地，所述的标签蛋白位于水解酶的n端或c端。
36、优选地，所述的标签蛋白为组氨酸标签。
37、优选地，所述的标签蛋白的序列为his-his-his-his-his-his。
38、优选地，所述的标签蛋白与水解酶之间连接有可切割或不可切割的连接短肽。
39、优选地，所述可切割或不可切割的连接短肽表达后，不被宿主细胞的蛋白酶识别和切割。
40、优选地，所述的标签蛋白与水解酶不通过连接短肽连接。
41、优选地，所述连接短肽的序列为四个天冬氨酸的赖氨酸羧基端肽键：天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸(ddddk)
42、作为一个优选的例子，seq id no.11基础上引入标签蛋白后的氨基酸序列如seqid no.2所示。
43、本发明的有益效果在于：
44、本发明通过合适的基因突变，将动物的水解酶基因插入到工程细胞中，并成功发酵得到透明质酸酶，其催化效率，水解透明质酸的活性高于现有技术。
45、本发明的工程细胞可以重复发酵，并且酶活能维持在高的水平。
1.一种透明质酸水解酶，其特征在于：
2.一种透明质酸水解酶，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的透明质酸水解酶，其特征在于：
4.一种透明质酸水解酶前体，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的透明质酸水解酶前体，其特征在于：
6.一种基因，其特征在于：
7.一种基因，其特征在于：
8.一种重组载体，其特征在于：
9.一种工程细胞，其特征在于：
10.根据权利要求9所述的工程细胞，其特征在于：
11.一种透明质酸水解酶的应用，其特征在于：
12.一种构建工程细胞的方法，其特征在于：
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
14.一种生产透明质酸水解酶的方法，其特征在于：用权利要求9或10所述的工程细胞发酵得到。
