本发明涉及医学生物，涉及一种sept7基因敲除的car-t细胞及制备方法与应用，具体涉及通过sept7基因修饰获得car-t细胞。
背景技术：
1、car-t(chimeric antigen receptor t cell，嵌合抗原受体t细胞)疗法，是指通过基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域及t细胞激活信号的遗传物质转入t细胞，使t细胞直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而被激活，通过释放穿孔素、颗粒酶素b等直接杀伤肿瘤细胞，同时还通过释放细胞因子募集人体内源性免疫细胞杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的；而且还可以形成免疫记忆t细胞，从而获得特异性的抗肿瘤长效机制，防止肿瘤的复发。通过基因修饰的方法优化改造car-t细胞以增强其治疗效果是常用的技术手段。
2、septins是gtp结合蛋白,与家族其他成员形成septins支架被称为新型细胞骨架蛋白,参与细胞极性、分裂和凋亡等功能。人体内编码septins蛋白的基因有13种,根据序列相似性,分为sept2、sept3、sept6和sept7四个亚家族。sept7亚家族仅包含septin7(sept7)一个成员。sept7位于染色体7p14.4-14.1,编码418个氨基酸,包括一个gtp结合模体。sept7基因在细胞增殖、细胞周期调控、诱导细胞凋亡等方面发挥重要作用。本发明通过使用crispr-cas9技术对car-t细胞的sept7基因进行敲除，获得了一种具有强大增殖扩增能力和抗凋亡能力的car-t细胞。
技术实现思路
1、本发明的目的在于，提供一种sept7基因敲除的car-t细胞及制备方法与应用，通过使用crispr-cas9技术对car-t细胞的sept7基因进行敲除，获得了一种具有强大增殖扩增能力和抗凋亡能力的car-t细胞。
2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
3、一种sept7基因敲除的car-t细胞的制备方法，通过使用crispr-cas9技术对car-t细胞的sept7基因进行敲除，包括以下步骤：
4、s1：grna设计及载体构建
5、针对人的septin7基因设计以下grna：
6、hseptin7[grna#6182]：atatttaagattgcgtaaag-tgg；
7、hseptin7[grna#6955]：gagagtcctctagacaaatt-tgg；
8、hseptin7[grna#6147]：caccaagaagtacttgcata-agg；
9、hseptin7[grna#6681]：agagtcctctagacaaattt-ggg；
10、s2：在293t细胞中检测所选grna的靶向效率
11、s3：cripsr/cas9介导car-t细胞中sept7基因敲除。
12、进一步的，所述s3具体包括：
13、s301：利用293t中筛选出来效率最高的两条grna构建双grna+cas9表达载体；
14、s301：t细胞经过含il-2的培养基培养，有助于增加电转效率：在rpmi1640培养基添加cd3和cd28的抗体，以及il-2，使用该培养基培养t细胞60小时；然后通过磁珠分离将cd3/cd28双阳性的t细胞分离；
15、s303：测试t细胞的电转条件，如质粒加入量、电穿孔脉冲等；
16、s304：然后将1e+6的t细胞通过300g离心5分钟的方式，利用pbs洗涤两次，将质粒与细胞混匀于电转液中，然后转移到电转杯中使用测试的最佳电转条件进行电转，电转完成后将电转液替换为合适的t细胞培养基培养；
17、s305：电转三天后，流式分选gfp通道的绿色荧光表达水平高且均一的阳性细胞；
18、s306：挑单克隆培养扩增t细胞，提取细胞基因组dna，pcr扩增grna靶向区域并送测序；
19、s307：分析测序结果，选择合适的sept7基因敲除的car-t细胞。
20、进一步的，所述s2具体包括：
21、s201：293t细胞转染：各取0.5ug上述质粒和1μlp3000 reagent稀释在25μl opti-mem培养基中；接着将1.5μl lipofectamine 3000试剂稀释在25μl opti-mem中，然后与稀释的dna/p3000试剂混合；将混合物在室温下孵育5分钟，然后滴加到融合度～80％的24孔板每个细胞孔中；
22、s202：流式分选：在转染后的第三天，利用胰酶将293t细胞消化为单细胞，然后进行流式分选所需的gfp荧光细胞，使用未转染的细胞定义背景荧光水平；经过facs分选后，gfp阳性细胞被收集；流式分选gfp通道中绿色荧光表达水平高且均一的阳性细胞；
23、s203：基因组提取：将收集的细胞加入quickextract buffer进行裂解，以3000–4000cells/μl为佳，65℃孵育20分钟，98℃孵育10分钟；
24、s204：设计引物及扩增ko产物：针对每个grna靶向的区域，在两侧设计pcr引物并扩增对应靶向区域，将pcr产物送测序；
25、s205：分析测序结果，选择效率较高的grna序列用于后续的t细胞sept7基因敲除。
26、本发明的另一目的在于，提供sept7敲除的car-t细胞在体外扩增和抗凋亡产品制备中的应用。
27、本发明的另一目的在于，提供sept7敲除的car-t细胞在抑制荷瘤小鼠体内控制肿瘤体内扩增产品制备中的应用。
28、本发明的另一目的在于，提供sept7敲除的car-t细胞在制备清除大量肿瘤细胞产品中的应用。
29、本发明的有益效果为：
30、本发明的sept7基因敲除的car-t细胞及制备方法与应用，通过使用crispr-cas9技术对car-t细胞的sept7基因进行敲除，获得了一种具有强大增殖扩增能力和抗凋亡能力的car-t细胞；sept7敲除的car-t细胞具有显著的体外扩增优势和抗凋亡优势；动物实验显示sept7敲除的car-t细胞在极小剂量便可在荷瘤小鼠体内控制肿瘤显示显著的体内扩增优势；sept7低表达的car-t细胞在患者体内可大量扩增并清除大量肿瘤细胞；敲除sept7基因增强car-t细胞增殖能力与抗凋亡能力的具体机制；可应用于相应的产品开发与制备。
31、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
1.一种sept7基因敲除的car-t细胞的制备方法，通过使用crispr-cas9技术对car-t细胞的sept7基因进行敲除，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的sept7基因敲除的car-t细胞的制备方法，其特征在于：所述s3具体包括：
3.如权利要求1所述的sept7基因敲除的car-t细胞的制备方法，其特征在于：所述s2具体包括：
4.权利要求1-4任意一项方法制备的sept7敲除的car-t细胞在体外扩增和抗凋亡产品制备中的应用。
5.权利要求1-4任意一项方法制备的sept7敲除的car-t细胞在抑制荷瘤小鼠体内控制肿瘤体内扩增产品制备中的应用。
6.权利要求1-4任意一项方法制备的sept7敲除的car-t细胞在制备清除大量肿瘤细胞产品中的应用。
