本发明属于生物技术和分子诊断，具体涉及一种基于dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法及其应用。
背景技术：
1、对虾白斑综合症病毒(wssv)自20世纪90年代开始在亚洲地区养殖对虾中不断爆发并流行，感染的对虾死亡率高达100％。白斑综合症病毒是在已经报道的对虾病毒中，毒力最强，危害最大，感染宿主的范围和分布地域十分广泛的一种病毒，可以感染多种对虾(如中国对虾、南美白对虾、日本对虾、斑节对虾等)造成死亡，而且能被许多水生生物如蟹类、桡足类、轮虫类、卤虫和一些昆虫幼虫携带而到处传播，甚至对虾饵料如保存处理不当也会携带白斑病毒从而感染养殖对虾。全世界各国对虾产量仅由于白斑病就损失近一半，我国也不例外，每年各水产养殖大省也都会受到白斑病毒的侵袭，给养殖户造成巨大损失。建立检测wssv快速准确的方法，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。
2、迄今仍然没有能有效控制wssv疫情的技术措施。实践证明，预防并切断传播途径是控制疾病爆发和流行的最为有效的途径和方法，其中主要关键技术就是早期敏感诊断，不仅要加强亲虾、虾苗、仔虾、成虾等的养殖动物日常检测，同时还要加强养殖水体中微小生物、池塘底泥以及对虾投喂饵料的实时监测，才能使整个养殖流程形成无疫病的闭环，为对虾白斑综合症病毒的防控提供保障。
3、目前wssv的常用检测方法有：目测观察法、组织染色法、电子显微镜检查法、酶联免疫法、pcr和定量pcr方法。目测观察法和组织染色法虽然用时较短，但是一般只能在病毒严重感染，产生组织病变时才能确诊，不适用于早期诊断；电子显微镜检查法、酶联免疫法以及pcr方法等虽然灵敏度高，特异性强，但操作繁琐复杂，需要昂贵的实验仪器和专业的技术人员，耗时较长，限制了在生产中的推广应用。与一般pcr技术相比，荧光pcr检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。
4、公开号为cn107287354a，申请日为2017年8月9日的中国专利公开了一种环介导等温扩增法检测对虾白斑综合症病毒的方法，根据对虾白斑综合症病毒囊膜基因的保守序列，设计了lamp引物，建立lamp反应体系，并通过在lamp反应中添加不同的ph指示剂，以达到通过肉眼观察颜色变化判定靶基因被有效扩增的目的，但是肉眼观察的lamp反应体系颜色与阳性对照的差异存在较大主观误差，且仅能判断wssv是否存在，无法进一步得知的病毒载量范围；公开号为cn113755648a，申请日为2021年10月28日的中国专利提供了wssv实时荧光定量pcr检测引物探针组合、试剂盒及方法，采用该引物探针组合能够实现高灵敏度、高特异性的wssv检测，为对虾白斑综合症病毒的早期检测和精准防控提供重要的技术支撑，但该发明中未披露任何关于如何增强实时荧光定量pcr灵敏度的技术特征。
5、高灵敏度、高特异性的对虾白斑综合症病毒检测方法既是有效控制对虾白斑综合症病毒传播，避免疫病大面积爆发的基础和前提，也是各级水生动物疫病防控机构、科研机构以及大规模对虾养殖场对该病监测、检疫的迫切需要，因此结合荧光pcr检测技术，建立一种灵敏、准确、快捷、方便的wssv病原检测方法是减少白斑综合征发生和危害的重要途径。
技术实现思路
1、为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法及其应用，利用特定探针和引物设计，提供更高的wssv检测特异性和准确性，减少了与其他病原体的交叉反应，在低病毒载量的样本检测中可以表现出更高的灵敏度。
2、本发明的技术方案如下：
3、本发明的目的之一在于提供一种基于dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法，所述检测方法以虾中白斑综合症病毒wssv基因为目标，设计荧光定量pcr的探针引物组合，并在pcr检测混合物中添加dmso至最终体积的5-10％，通过荧光定量pcr区分wssv和其他病原体。
4、进一步的，所述引物前端序列如seq id no.1所示，引物末端序列如seq id no.2所示；所述探针序列如seq id no.3所示。
5、进一步的，所述探针的5'端有荧光标记fam、3'端连接荧光淬灭基团bhq1。
6、进一步的，所述探针长度为18-25bp、tm值为58-62℃。
7、进一步的，所述检测方法包括以下步骤：
8、s1、设计、合成并组合如权利要求2所述的引物和探针；
9、s2、制备重组对虾白斑综合症病毒wssv质粒作为阳性标准质粒；
10、s3、提取待测样品的dna，加入含有s1所设计引物和探针的荧光定量pcr反应体系，以待测样品dna为模板，对待测样品进行荧光定量pcr扩增反应；
11、s4、设置阳性对照和阴性对照，将配好的荧光定量pcr反应体系于荧光定量pcr扩增仪上进行反应；
12、s5、通过荧光定量pcr的扩增情况，判定待测样品的病毒载量。
13、进一步的，所述s2中重组对虾白斑综合症病毒wssv质粒序列如seq id no.4所示。
14、进一步的，所述s3中荧光定量pcr反应体系为0.2μm引物、0.4μm探针、10μm dntps、1.5utaq聚合酶和pcr缓冲液，并添加最终体积5-10％的dmso至20μl。
15、进一步的，所述s4中反应程序如下：预变性95℃3min，变性95℃
16、10s、退火延申60℃30s，循环45次。
17、进一步的，所述检测方法用于非疾病的诊断和治疗目的的对虾白斑综合症病毒的检测，包括用于对虾白斑综合症病毒的检疫和流行病学监测，用于对动物受精卵、苗种、幼体、成体的对虾白斑综合症病毒检测，或用于进行环境、饲料、工具的检测。
18、本发明的目的之二在于提供一种dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法在水产养殖及病原体检测中的应用。
19、相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
20、1、本发明利用对虾白斑综合症病毒基因组序列设计一对引物及荧光探针组合，通过优化荧光定量pcr反应条件和反应体系，建立起对虾白斑综合症病毒的荧光定量pcr检测方法，不仅检测灵敏度高，特异性强、可重复性好，定量线性范围广，而且克服了传统pcr在众多病原体共存的环境中特异性和准确性方面可能存在的局限，使其对于wssv病原体的检测更为可靠，尤其是在多种病原体共存的水产养殖环境中。
21、2、本发明结合所创新的引物及荧光探针，在荧光定量pcr反应体系中添加适量的dmso，以提高检测对虾白斑综合症病毒(wssv)的灵敏度，解决了现有的pcr方法在处理高gc含量的dna序列或复杂的dna结构时，常常遇到扩增效率低和特异性不足的问题，已经在低病毒载量样本的检测中，传统pcr方法的灵敏度不足，难以实现早期诊断的缺陷。dmso的添加降低了dna双链的热稳定性，有助于打开复杂的dna结构，特别是在高gc含量区域。dmso的添加提高了本发明引物的结合效率和扩增效率，使本发明检测方法在低病毒载量样本中的灵敏度有所提升，能够实现更早期的wssv病毒检测。
22、3、本发明采用具有高特异性的探针和引物，能够精确区分wssv和其他潜在病原体，减少与其他病原体的交叉反应，减少误诊的风险，确保了检测结果的准确性，且所述检测方法对各种复杂样本(如高gc含量或结构复杂的dna区域)都表现出良好的适应性和稳定性，可广泛应用于水产养殖及病原体检测行业，对wssv病原绝对定量相关的基础科学研究也有较高的科学及实用价值。
1.一种基于dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法，其特征在于，所述检测方法以虾中白斑综合症病毒wssv基因为目标，设计荧光定量pcr的探针引物组合，并在pcr检测混合物中添加dmso至最终体积的5-10％，通过荧光定量pcr区分wssv和其他病原体。
2.如权利要求1所述的一种基于dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法，其特征在于，所述引物前端序列如seq id no.1所示，引物末端序列如seq id no.2所示；所述探针序列如seq id no.3所示。
3.如权利要求2所述的一种基于dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法，其特征在于，所述探针的5'端有荧光标记fam、3'端连接荧光淬灭基团bhq1。
4.如权利要求3所述的一种基于dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法，其特征在于，所述探针长度为18-25bp、tm值为58-62℃。
5.如权利要求1所述的一种基于dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的一种基于dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法，其特征在于，所述s2中重组对虾白斑综合症病毒wssv质粒序列如seq id no.4所示。
7.如权利要求5所述的一种基于dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法，其特征在于，所述s3中荧光定量pcr反应体系为0.2μm引物、0.4μm探针、10μm dntps、1.5u taq聚合酶和pcr缓冲液，并添加最终体积5-10％的dmso至20μl。
8.如权利要求5所述的一种基于dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法，其特征在于，所述s4中反应程序如下：预变性95℃3min，变性95℃10s、退火延申60℃30s，循环45次。
9.如权利要求1所述的一种基于dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法，其特征在于，所述检测方法用于非疾病的诊断和治疗目的的对虾白斑综合症病毒的检测，包括用于对虾白斑综合症病毒的检疫和流行病学监测，用于对动物受精卵、苗种、幼体、成体的对虾白斑综合症病毒检测，或用于进行环境、饲料、工具的检测。
10.一种如权利要求1-9任一所述基于dmso增强荧光定量pcr对wssv的检测方法在水产养殖及病原体检测中的应用。
