本技术涉及生物领域，具体的涉及一种单克隆抗体以及一种提高诱导多能干细胞（ipsc）基因组稳定性的方法。
背景技术：
1、诱导多能干细胞（ipsc）技术是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。分化的细胞在特定条件下被逆转后，恢复到全能性状态。ipsc技术不使用胚胎细胞或卵细胞，利用ipsc技术可以用病人自己的体细胞制备专有的干细胞，从而大大降低了免疫排斥反应发生的可能性。ipsc的岀现，在干细胞、表观遗传学以及生物医学等研究领域都引起了强烈的反响，使人们对多能性的调控机制有了突破性的新认识，进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离。ipsc在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选以及神经系统疾病、心血管疾病等临床疾病治疗等方面具有巨大的潜在价值。
2、最初流行的建立ipsc细胞的方法，是将表达yamanaka因子的逆转录病毒感染体细胞，感染的细胞在标准的esc培养基中生长，然后通过药物筛选激活多潜能相关基因启动子；一旦得到形态上像esc的克隆，则用多种方法检测ipsc细胞的多潜能性。然而，这种方法的效率极低而这样产生的ipsc细胞又有其自身的安全性问题，例如病毒插入导致的突变和c-myc产生癌症的可能。由此科研工作者在多个层面改进了该技术。首先ipsc细胞的选择可通过克隆的形态学方法，而不再通过药物筛选。在细胞转导超过10d后，具备esc克隆形态的大克隆被挑选出来，以最严格的四倍体胚胎补偿法实验来评估这些ipsc克隆的发育潜些实验显示了重编程非遗传修饰的体细胞并挑选ipsc细胞是可行的。其次，在应用ipsc细胞之前，必须仔细检查其安全性，因为c-myc是公认的癌基因。为了减少ipsc细胞的成癌性，在诱导过程中省略c-myc，而只运用另外3个因子。由此带来的诱导效率降低问题，则可由加入其他小分子来解决。再次，逆转录病毒和慢病毒的应用也可带来安全问题，因为它们在将外源基因和病毒序列插人基因组的时候可能带来突变。通过综合2a多肽序列和内部核糖体进人位点技术，4种因子可被单一病毒载体表达，从而减少病毒插人位点和突变概率。也有报道应用腺病毒短暂表达4种因子，从而避免了外源dna对染色体(质)的插入。然而，不论使用腺病毒，还是其他转染方法诱导效率都会降低。
3、为解决上述问题，如利用低基因组整合率的腺病毒载体、融合表达质粒、转座子系统、小分子及蛋白转导等方法减少或替换具有潜在插入整合风险的病毒载体方法。为提高重编程效率，在重编程过程中，可添加具有调控表观遗传作用的小分子化合物(dna甲基转移酶抑制剂、赖氨酸特异性去甲基化酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和组蛋白甲基转移酶抑制剂等)，以及各种信号通路抑制剂，如mek抑制剂、gsk3抑制剂、tgf-β受体阻断剂、钙通道激动剂和wnt3a抑制剂等。另外，抗氧化剂维生素c也能够提高人和鼠ipsc的产生效率。尽管这些不同类型的小分子能够一定程度地提高重编程效率，但重编程仍然离不开某个特定基因的高表达。也有研究联合7种小分子化合物就能成功诱导出cipsc，这些psc与常规的ipsc具有相似的基因表达谱、表观遗传学修饰及多向分化潜能，这种化学诱导方法无疑是体细胞重编程领域的又一突破。但是使用的化合物种类众多，成本高昂，影响了大规模推广使用。
4、ipsc技术的开发与不断完善为建立患者及某些疾病的特异性ipsc系提供了一条有效途径，在药物开发领域具有重大的影响。但是如何更加高效的制备ipsc细胞是重要的研究方向。
技术实现思路
1、本发明一方面，提供了一种人皮肤角质形成细胞诱导成为诱导多能干细胞（ipsc）的方法，该方法能够具有较好的基因组稳定性以及诱导效率。
2、具体的，本发明所述的方法通过添加特异性抑制 p53的单克隆抗体p53-r11来提高诱导多能干细胞的效率以及诱导后的诱导多能干细胞的活性。
3、更进一步的，本发明的p53的单克隆抗体命名为p53-r11抗体，该抗体的轻链可变区序列如seq id no：1所示，重链可变区序列如seq id no：2所示。
4、具体的，本发明中使用的抗体可以被保守性替代。保守性氨基酸置换是优选的，即，例如，作为极性酸性氨基酸的天冬氨酸-谷氨酸；作为极性碱性氨基酸的赖氨酸/精氨酸/组氨酸；作为非极性或疏水性氨基酸的亮氨酸/异亮氨酸/甲硫氨酸/缬氨酸/丙氨酸/甘氨酸/脯氨酸；作为极性或不带电的亲水性氨基酸的丝氨酸/苏氨酸。保守性氨基酸置换还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理预期：将亮氨酸替换为异亮氨酸或缬氨酸、将天冬氨酸替换为谷氨酸、将苏氨酸替换为丝氨酸、或类似地将氨基酸替换为结构上相关的氨基酸将不会对得到的多肽的性质产生大的影响。可以通过测定抗体的比活性容易地确定氨基酸替换是否产生功能性抗体变体。
5、导入至体细胞的启动因子rna例如包括oct3/4的mrna、sox-2的mrna、klf4的mrna、及c-myc的mrna。作为启动因子rna，可使用对oct3/4进行改良的m3o。而且，启动因子rna可进一步含有选自由lin28a、foxh1、lin28b、glis1、p53-显性失活、p53-p275s、l-myc、nanog、dppa2、dppa4、dppa5、zic3、bcl-2、e-ras、tpt1、sall2、nac1、dax1、tert、znf206、foxd3、rex1、utf1、klf2、klf5、esrrb、mir-291-3p、mir-294、mir-295、nr5a1、nr5a2、tbx3、mbd3sh、th2a、th2b、及p53dd所构成的群的至少一种因子的mrna。这些mrna可从trilink获得。另外，尽管此处基因符号以人类进行记载，但并不意图通过大小写字母表述来限制种类。其中，在实施例中，根据实际使用的生物种类而表示基因符号。
6、使用用于异位表达重编程基因的逆转录病毒或慢病毒载体实现从人体细胞对多潜能干细胞的诱导。重组逆转录病毒如莫洛尼鼠白血病病毒具有以稳定方式整合到宿主基因组中的能力。它们含有逆转录酶，该酶允许整合到宿主基因组中。慢病毒是逆转录病毒的亚类。由于它们具有整合到非分裂细胞和分裂细胞的基因组中的能力，因此它们广泛地适合用作载体。当病毒进入细胞时，rna形式的病毒基因组被逆转录以产生dna，然后dna通过病毒整合酶被插入基因组的随机位置。因此，目前的成功重编程技术依赖于基于整合的病毒途径。
7、本发明方法的某些方面可以涉及使用重编程因子，所述重编程因子可包含选自由以下组成的组的一种或多种：sox、oct、nanog、lin-28、klf4，以及或c-myc或l-myc，或它们的组合，例如，sox、oct、nanog和任选的lin-28的集合，sox、oct、klf4和任选的c-myc或l-myc的集合，或这六种因子的组合。在某些方面，为了降低c-myc表达的可能毒性作用，sv40大t基因(sv40lt)可以与c-myc一起被包括。在具体的方面，外源元件，dna或rna，可以包含一个或多个多顺反子盒，如在相同的转录调控元件下的两个或更多个重编程因子基因。
8、 mrna也可以通过由假尿苷(ψ)、5-甲基尿苷(5meu)、n1-甲基假尿苷(me1ψ)、5-甲氧基尿苷(5mou)、5-羟基甲基尿苷(5hmu)、5-甲酰尿苷(5fu)、5-羧甲基酯尿苷(5camu)、噻吩并鸟苷(thg)、n4-甲基胞苷(me4c)、5-甲基胞苷(m5c)、5-甲氧基胞苷(5moc)、5-羟基甲基胞苷(5hmc)、5-羟基胞苷(5hoc)、5-甲酰胞苷(5fc)、5-羧基胞苷(5cac)、n6-甲基-2-氨基腺苷(m6dap)、二氨基嘌呤(dap)、5-甲基尿苷(m5u)、2'-o-甲基尿苷(um或m2'-ou)、2-硫尿苷(s2u)、及n6-甲基腺苷(m6a)所构成的群的至少一种进行修饰。
9、在本发明的某些方面，在至少一部分重编程过程中，可以在存在或不存在一种或多种信号传导抑制剂的情况下维持细胞，所述信号传导抑制剂抑制信号传导级联中所涉及的信号转导子，例如，在mek抑制剂、gsk3抑制剂、tgf-β受体抑制剂，和/或肌球蛋白ii atp酶抑制剂，或这些相同通路内的其他信号转导子的抑制剂的存在下维持细胞。在某些方面，rock抑制剂如ha-100或h1152可用于促进重编程细胞和所得到的ips细胞的克隆扩展。高浓度的fgf与特定重编程培养基如条件化的人es细胞培养基或不含血清的n2b27培养基的组合也可用于增大重编程效率。在优选的方面，该培养基是限定培养基或不含异种物质的培养基。
10、用于培养一个(多个)细胞的培养器皿可以包括，但不特别局限于：瓶、组织培养瓶、皿、皮氏培养皿、组织培养皿、多皿(multi dish)、微板、微孔板、多板(multi plate)、多孔板、微玻片、腔室玻片、管、盘、 chamber、培养袋，和转瓶，只要它能够培养其中的干细胞即可。可以在至少或约0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、550ml、600ml、800ml、1000ml、1500ml，或从其导出的任意范围的体积中培养细胞，这取决于培养需要。在某个实施方案中，培养器皿可以是生物反应器，该生物反应器可以指支持生物活性环境的任何装置或系统。生物反应器可以具有至少或约2升、4升、5升、6升、8升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、150升、200升、500升、1立方米、2立方米、4立方米、6立方米、8立方米、10立方米、15立方米。
11、本发明的方法也可用于诸如重编程细胞或干细胞的细胞的悬浮培养，包括在载体上的悬浮培养或凝胶/生物聚合物封装的悬浮培养。术语细胞的悬浮培养意指就培养器皿或培养基中的饲养细胞(如果使用的话)而言，在非粘附条件下培养细胞。细胞的悬浮培养包括细胞的解离培养和细胞的聚集体悬浮培养。术语细胞的解离培养意指培养悬浮的干细胞，干细胞的解离培养包括单一细胞或由多个细胞(例如，约2至400个细胞)组成的小细胞聚集体的解离培养。当前述解离培养
12、继续进行时，培养的、解离的干细胞可以形成较大的细胞聚集体，此后可以进行聚集体悬浮培养。
13、本发明进一步的，提供所述制备的ipsc细胞通过分化制备成为靶细胞中用途。
14、有益效果：本发明提供了一种人皮肤角质形成细胞诱导成为诱导多能干细胞（ipsc）的方法，该方法能够具有较好的基因组稳定性以及诱导效率。所述的方法通过添加特异性抑制 p53的单克隆抗体来提高诱导多能干细胞的效率以及诱导后的诱导多能干细胞的活性。
1.一种特异性针对p53的单克隆抗体p53-r11，其特征在于，该抗体的轻链可变区序列如seq id no：1所示，重链可变区序列如seq id no：2所示。
2.如权利要求1所述的特异性针对p53的单克隆抗体p53-r11在制备抑制p53活性的试剂中的用途。
3.一种提高诱导多能干细胞ipsc基因组稳定性的方法，其特征在于，在诱导人皮肤角质形成细胞成为诱导多能干细胞ipsc的过程中，在导入重编程因子的同时，使用权利要求1所述的特异性针对p53的单克隆抗体p53-r11。
4.一种用于诱导人皮肤角质形成细胞成为诱导多能干细胞ipsc的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1所述的特异性针对p53的单克隆抗体p53-r11、仙台病毒重编程试剂盒和培养基。
