本发明涉及基因工程与发酵工程，尤其是一种羟基酪醇生产菌株及其构建方法与应用。
背景技术：
1、羟基酪醇主要存在于橄榄植物，具有抗癌和抗氧化作用。现阶段羟基酪醇的生产方式为天然提取法和化学合成法。其中天然提取法的效率低，工艺繁琐，对环境污染大；化学合成法需要昂贵的催化剂，价格昂贵，条件严格。微生物发酵法因其具有生产原料安全、成本低廉、过程简单、易于工业化等优势，成为代替目前生产方法的首选，酵母菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌等菌种常作为此方法的底盘细胞发酵工业产物。其中大肠杆菌因其遗传背景清晰、基因编辑方法完善，易于培养等优点，成为微生物直接发酵法生产乳清酸的最好选择。然而，大肠杆菌体内的羟基酪醇的代谢途径冗长，关键酶的表达效果弱且碳损严重，不利于羟基酪醇的合成积累。因此，探究高效的羟基酪醇生产菌株及羟基酪醇合成途径是现阶段亟待解决的技术问题。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种羟基酪醇生产菌株。
2、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述羟基酪醇生产菌株的构建方法。
3、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述羟基酪醇生产菌株的应用。
4、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
5、一种质粒，为质粒pet-ht-1，其核苷酸序列如序列表seq id no.15所示。
6、优选的，上述质粒，以pet28a(+)质粒基因组为模板，携带复制起始位点、卡那霉素抗性、t7启动子、核糖体结合位点和终止子等质粒元件，敲除了阻遏蛋白基因 laci，同时携带了来源于 saccharomyes cerevisiaescy4741的 aro10 d331v和 adh6基因，以及来源于 klebsiella pneumoniae的 hpabc基因，基因均选用t7启动子强化转录。
7、优选的，上述质粒，苯丙酮酸脱羧酶基因 aro10 d331v基因的核苷酸序列如序列表seqid no.8所示，乙醇脱氢酶基因 adh6基因的核苷酸序列如序列表seq id no.9所示，4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因 hpabc的核苷酸序列如序列表seq id no.10所示， t7启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.13所示，终止子的核苷酸序列如序列表seq id no.14所示，pet28a(+)质粒的核苷酸序列如序列表seq id no.16所示。
8、一种羟基酪醇生产菌株，为菌株ht-8，缺失了 tyrr、tyrb、feab基因，引入了 t7 rnap基因，上调了 arog fbr 、tyra fbr 、talb基因，所述生产菌携带了上述质粒pet-ht-1，所述质粒异源表达了来源于 saccharomyes cerevisiaescy4741的 aro10 d331v和 adh6基因，以及来源于 klebsiella pneumoniae的 hpabc基因。
9、优选的，上述羟基酪醇生产菌株，以 e.coliw3110作为底盘菌株，利用crispr-cas9基因编辑技术敲除了菌株基因组上的转录调控因子基因 tyrr、芳香族氨基酸转氨酶基因 tyrb、苯乙醛脱氢酶基因 feab；利用xylf启动子强化t7 rna聚合酶基因 t7 rnap转录，并整合到基因组ycdn基因位点；利用trc启动子强化dahp合成酶基因 arog fbr转录强度，并整合到基因组yeel基因位点；利用trc启动子强化预苯酸脱氢酶基因 tyra fbr转录强度，并整合到基因组yeep基因位点；利用trc启动子强化转醛缩酶基因 talb转录强度，并整合到基因组yjip基因位点。
10、优选的，上述羟基酪醇生产菌株，所述 e.coli w3110作为出发菌株为 e.coli w3110 atcc 27325。
11、优选的，上述羟基酪醇生产菌株，所述转录调控因子基因 tyrr的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示，芳香族氨基酸转氨酶基因 tyrb的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示，苯乙醛脱氢酶基因 feab的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示，t7 rna聚合酶基因 t7 rnap基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示，dahp合成酶基因 arog fbr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示，预苯酸脱氢酶基因 tyra fbr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示，转醛缩酶基因 talb的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示，xylf启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.11所示，trc启动子的核苷酸序列如序列表seq idno.12所示。
12、上述羟基酪醇生产菌株的构建方法，在出发菌株 e.coli w3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
13、（1）底盘菌改造：
14、敲除反馈抑制蛋白基因： tyrr；
15、敲除羟基酪醇分解途径基因： tyrb、feab；
16、引入了 t7 rnap基因，上调了 arog fbr 、tyra fbr 、talb基因；
17、（2）pet-ht-1质粒系统：将质粒pet-ht-1转化进入步骤（1）得到的感受态细胞。
18、上述步骤（2）中pet-ht-1质粒携带复制起始位点、卡那霉素抗性、t7启动子、核糖体结合位点和终止子等质粒元件，敲除了阻遏蛋白基因 laci，该质粒高效表达了来源于 saccharomyes cerevisiaescy4741的 aro10 d331v和 adh6基因，以及来源于 klebsiella pneumoniae的 hpabc基因，其中， aro10 d331v、 adh6基因和 hpabc基因均选用t7启动子强化转录。
19、上述羟基酪醇生产菌株在发酵生产羟基酪醇方面的应用。
20、优选的，上述羟基酪醇生产菌株的应用，在培养基中进行发酵培养，培养基包括但不限于碳源、氮源、无机盐、维生素等；发酵条件包括发酵温度、发酵ph、发酵溶氧条件、发酵压力、发酵时间等。
21、优选的，上述羟基酪醇生产菌株的应用，使用机械搅拌式发酵罐进行培养，具体步骤如下：
22、①斜面培养：取羟基酪醇生产菌株接种在斜面培养基上，32℃培养12-16h，斜面培养基选用通用lb固体培养基；
23、②种子培养：培养温度为32-34℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养ph在6.4±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，当od600nm为15时达到接种要求；
24、③发酵培养：发酵接种量为20%，培养温度为32-34℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养ph在6.4±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，通过流加80%葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5 g/l，当od600为20-30时添加木糖，发酵周期为48h。
25、优选的，上述羟基酪醇生产菌株的应用，所述步骤②中采用的种子培养基为：葡萄糖20g/l，酵母粉3g/l，蛋白胨1g/l，mgso4.7h2o 1g/l，kh2po42g/l，硫酸铵1g/l，feso4.7h2o10mg/l，其余为水。
26、优选的，上述羟基酪醇生产菌株的应用，所述步骤③采用的发酵培养基为：mgso4.7h2o 1g/l，酵母粉4g/l，蛋白胨2g/l，硫酸铵1g/l，kh2po43g/l，谷氨酸2g/l，甲硫氨酸0.5g/l，feso4.7h2o 20-30mg/l，mnso410-15mg/l，木糖5g/l，vb11-9mg/l，其余为水。
27、优选的，上述羟基酪醇生产菌株的应用，所述发酵培养基中vb1的添加量为5.0mg/l。
28、上述培养基均可采用标准方法制备获得。
29、有益效果：
30、上述羟基酪醇生产菌株，能够高效利用葡萄糖为碳源从头合成羟基酪醇，无需添加酪氨酸、多巴胺等昂贵底物，具有良好的羟基酪醇合成能力，且生产成本低、发酵周期短、菌株性能稳定，该菌株缺失了 tyrr、tyrb、feab基因，引入了 t7 rnap基因，上调了 arog fbr 、 tyra fbr 、talb基因，所述生产菌携带了质粒pet-ht-1，所述质粒异源表达了来源于 saccharomyes cerevisiaescy4741的 aro10 d331v和 adh6基因，以及来源于 klebsiella pneumoniae的 hpabc基因，所述菌株将关键酶利用质粒系统表达，可以实现对目标基因的高水平定向表达，具有较高的羟基酪醇合成效率；发酵应用过程中对发酵过程中vb1的添加量进行优化，一方面能够保证苯丙酮酸脱羧酶的催化需求，维持苯丙酮酸脱羧酶的辅酶供应，提高羟基酪醇合成效率，另一方面能够避免高浓度vb1辅酶因子造成的资源浪费，有效提高了羟基酪醇的合成效率，具有优秀的工业应用前景。具体来说：
31、（1）通过敲除 tyrr、 tyrb、 feab基因，减少了羟基酪醇途径的分解；
32、（2）通过上调 arog fbr 、tyra fbr 、talb基因，加强了羟基酪醇途径的碳通量；
33、（3）pet-ht-1质粒系统敲除了阻遏蛋白基因 laci，因此不需要另外添加诱导剂iptg，在工业化生产中具有生产成本低这一明显优势；该质粒上构建了来源于saccharomyes cerevisiae scy4741的 aro10 d331v、 adh6基因和来源于klebsiellapneumoniae的 hpabc基因，借助强启动子t7来控制表达；t7启动子是受控于 t7rnap基因的启动子，高活性的t7rnap合成mrna的速度比大肠杆菌rna聚合酶快5倍；当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过t7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；而t7rnap需要xylf启动子来诱导表达，因此在发酵培养基中添加了5g/l木糖来诱导木糖启动子xylf发挥作用；木糖具有良好的水溶性和生物相容性，并且在体内能够被迅速代谢和排泄，具有廉价易得的优点，有利于羟基酪醇生产菌ht-8的工业化发酵生产。
34、（4）由于苯丙酮酸脱羧酶为硫胺素二磷酸依赖性脱羧酶，因此在发酵培养基中选择添加vb1作为辅酶因子，以用来提高苯丙酮酸脱羧酶的催化效率，在探究vb1浓度对菌体生物量和羟基酪醇产量的影响后发现，当培养基添加5mg/l的vb1时，能够最大发挥苯丙酮酸脱羧酶的催化效果，极大提高了生产效益。
1.一种质粒，其特征在于：其核苷酸序列如序列表seq id no.15所示。
2.一种羟基酪醇生产菌株，其特征在于：缺失了tyrr、tyrb、feab基因，引入了t7 rnap基因，上调了arogfbr、tyrafbr、talb基因，携带了权利要求1所述质粒pet-ht-1。
3.根据权利要求2所述的羟基酪醇生产菌株，其特征在于：以e.coli w3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的转录调控因子基因tyrr、芳香族氨基酸转氨酶基因tyrb、苯乙醛脱氢酶基因feab；利用xylf启动子强化t7 rna聚合酶基因t7 rnap转录，并整合到基因组ycdn基因位点；利用trc启动子强化dahp合成酶基因arogfbr转录强度，并整合到基因组yeel基因位点；利用trc启动子强化预苯酸脱氢酶基因tyrafbr转录强度，并整合到基因组yeep基因位点；利用trc启动子强化转醛缩酶基因talb转录强度，并整合到基因组yjip基因位点。
4.根据权利要求3所述的羟基酪醇生产菌株，其特征在于：所述e.coli w3110作为出发菌株为e.coli w3110 atcc 27325。
5.根据权利要求3所述的羟基酪醇生产菌株，其特征在于：所述转录调控因子基因tyrr的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示，芳香族氨基酸转氨酶基因tyrb的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示，苯乙醛脱氢酶基因feab的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示，t7 rna聚合酶基因t7 rnap基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示，dahp合成酶基因arogfbr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示，预苯酸脱氢酶基因tyrafbr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示，转醛缩酶基因talb的核苷酸序列如序列表seqid no.7所示，xylf启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.11所示，trc启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.12所示。
6.权利要求2-5之一所述羟基酪醇生产菌株的构建方法，其特征在于：在出发菌株e.coli w3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
7.权利要求2-5之一所述羟基酪醇生产菌株在发酵生产羟基酪醇方面的应用。
8.根据权利要求7所述的羟基酪醇生产菌株的应用，其特征在于：使用机械搅拌式发酵罐进行培养，具体步骤如下：
9.根据权利要求8所述的羟基酪醇生产菌株的应用，其特征在于：所述步骤②中采用的种子培养基为：葡萄糖20g/l，酵母粉3g/l，蛋白胨1g/l，mgso4.7h2o 1g/l，kh2po42g/l，硫酸铵1g/l，feso4.7h2o10mg/l，其余为水；所述步骤③采用的发酵培养基为：mgso4.7h2o 1g/l，酵母粉4g/l，蛋白胨2g/l，硫酸铵1g/l，kh2po43g/l，谷氨酸2g/l，甲硫氨酸0.5g/l，feso4.7h2o 20-30mg/l，mnso410-15mg/l，木糖5g/l，vb11-9mg/l，其余为水。
10.根据权利要求9所述的羟基酪醇生产菌株的应用，其特征在于：所述发酵培养基中vb1的添加量为5.0 mg/l。
