领域本公开涉及核酸，其包含含有有义链和反义链的双链rna分子，并进一步包含至少与该分子的有义或反义rna部分的5’端共价连接的单链dna分子，其中双链抑制性rna靶向心血管疾病基因；包含所述核酸分子的药物组合物以及治疗与心血管疾病基因表达水平升高有关的疾病(例如高胆固醇血症)的方法。
背景技术：
0、背景
1、与高胆固醇血症相关的心血管疾病，例如缺血性心血管疾病，是常见的病况，可导致心脏病以及高死亡率和发病率，可能由饮食不良、肥胖或遗传的基因功能失调引起。例如，高水平的脂蛋白(a)以及其他脂蛋白与动脉粥样硬化有关。胆固醇对动物细胞中膜的生物发生至关重要。缺乏水溶性意味着胆固醇会与脂蛋白一起在体内各处运输。载脂蛋白与磷脂、胆固醇和脂质一起形成，有助于胆固醇等脂质通过血流运输到身体的不同部位。脂蛋白根据大小分类，可形成hdl(高密度脂蛋白)、ldl(低密度脂蛋白)、idl(中间密度脂蛋白)、vldl(极低密度脂蛋白，very low-density lipoprotein)和uldl(超低密度脂蛋白，ultra-low-density lipoprotein)脂蛋白。
2、脂蛋白在其整个循环过程中的组成会发生变化，包含不同比例的载脂蛋白a(apoa)、b(apob)、c(apoc)、d(apod)或e(apoe)、甘油三酯、胆固醇和磷脂。例如，apob是uldl和ldl的主要载脂蛋白，具有两种同种型apob-48和apob-100。两种apob同种型都由一个单基因编码，其中较短的apob-48基因是在apob-100转录子的残基2180处进行rna编辑后产生的，从而产生了终止密码子。apob-100是ldl的主要结构蛋白，充当细胞受体的配体，可将胆固醇等转运到细胞中。
3、家族性高胆固醇血症是一种孤儿病，是血液中ldl胆固醇(ldl-c)水平升高的结果。该疾病是一种常染色体显性遗传病症，杂合(350-550mg/dl ldl-c)和纯合(650-1000mg/dl ldl-c)状态都会导致ldl-c升高。家族性高胆固醇血症的杂合型约占总人口的1:500。纯合状态则罕见得多，约为1:1,000,000。ldl-c的正常水平在130mg/dl左右。
4、高胆固醇血症在儿科患者中尤为严重，如果不及早诊断，可导致冠心病加速发展和过早死亡。如果能及早诊断和治疗，儿童可以具有正常的预期寿命。在成人中，由于突变或其他因素导致的高ldl-c与动脉粥样硬化风险增加直接相关，而动脉粥样硬化可导致冠状动脉疾病、中风或肾脏疾病。已知降低ldl-c水平可以减少动脉粥样硬化和相关病况的风险。他汀类药物可通过抑制hmg-coa还原酶来阻止胆固醇的从头合成，通过施用他汀类药物可从一开始降低ldl-c水平。一些受试者可从他汀类药物与其他治疗剂如依折麦布(ezetimibe)、考来替泊(colestipol)或烟酸相组合的联合疗法中获益。然而，hmg-coa还原酶的表达和合成会对于他汀类药物的抑制作用发生适应，并随着时间的推移而增加，因此，在产生他汀类药物抗性后，其有益效果只是暂时的或有限的。
5、因此，希望找到可单独使用或与现有治疗方法联合使用的替代疗法，以控制因ldl-c升高而引起的心血管疾病。
6、一种特异性消减基因功能的技术是将双链抑制性rna(也称为小抑制性或干扰rna(small inhibitory or interfering rna，sirna))导入细胞，从而破坏与sirna分子中包括的序列互补的mrna。sirna分子包含两条互补的rna链(有义链和反义链)，其相互退火形成双链rna分子。sirna分子通常(但不完全)来自所要消减的基因的外显子。许多生物体通过激活级联对双链rna的存在做出反应，该级联导致sirna的形成。双链rna的存在激活包含rnase iii的蛋白质复合物，rnase iii会将双链rna加工成更小的片段(sirna，长度为约21-29个核苷酸)，其成为核糖核蛋白复合物的一部分。sirna引导rnase复合物切割与sirna反义链互补的mrna，从而破坏该mrna。
7、抑制脂蛋白(a)的表达是已知的，使用抑制性rna来沉默脂蛋白(a)的表达也是已知的。例如，wo2019/092283公开了特定sirna序列的鉴定及其在治疗与脂蛋白(a)表达升高有关的心血管疾病(如冠心病、主动脉狭窄或中风)中的应用，该特定sirna序列靶向编码脂蛋白(a)的mrna的敲低。类似地，us9,932,586公开了特定sirna序列及其在治疗与脂蛋白(a)表达升高有关的心血管疾病(如伯格氏病(buerger’s disease)、冠心病、肾动脉狭窄、高脂蛋白血症(hyperapobetalipoproteinemia)、脑血管动脉粥样硬化、脑血管疾病和静脉血栓)中的应用，该特定sirna序列靶向脂蛋白(a)的表达。
8、apoc iii的过度表达与动脉粥样硬化和2型糖尿病有关。例如，wo2003/020765公开了利用源自apociii多肽的免疫原来控制动脉粥样硬化的疫苗接种方法及其在控制冠状动脉和脑血管疾病中的动脉粥样硬化斑块中的应用。wo2004/080375和wo2001/064008中公开了类似的疫苗接种方法。wo2014/205449和wo2014/179626中公开了使用反义寡核苷酸通过靶向apociii表达来改善胰岛素敏感性和治疗ii型糖尿病。
9、此外，wo2007/136989和wo2005/019418各自公开了使用针对dgat的反义化合物来调节dgat2的表达并治疗可受益于dgat2表达降低的病况，dgat2表达与可受益于血清甘油三酯水平降低的病况如高胆固醇血症、心血管疾病、ii型糖尿病和代谢综合征有关。wo2018/093966公开了使用针对dgat2和甘油二酯酰基转移酶1(diglycerideacyltransferase 1，dgat1)的rna沉默来治疗肥胖和肥胖相关疾病，如高胆固醇血症、心血管疾病、ii型糖尿病和代谢综合征。类似地，wo2005/044981公开了使用sirna来靶向dgat2以及许多其他基因靶标，以及它们在治疗可受益于甘油三酯调节的疾病中的用途。
10、本公开涉及核酸分子，其包含双链抑制性rna，该rna通过加入至少与有义或反义抑制性rna的5’端连接的短dna部分而进行修饰，并形成发夹结构。双链抑制性rna完全或主要使用天然核苷酸，并且不需要现有技术中双链rna分子通常用来改善药效学和药代动力学的经修饰的核苷酸或糖。所公开的双链抑制性rna具有沉默心血管基因靶标的活性，副作用可能更小。
11、发明描述
12、根据本发明的一个方面，提供了核酸分子，其包含
13、第一部分，包含双链抑制性核糖核酸(rna)分子，该分子包含有义链和反义链；和
14、第二部分，包含单链脱氧核糖核酸(dna)分子，其中所述单链dna分子的3’端与双链抑制性rna分子的有义链的5’端共价连接，或者其中单链dna分子的3’端与双链抑制性rna分子的反义链的5’共价连接，其特征在于，双链抑制性rna包含有义核苷酸序列，其编码与心血管疾病相关的心血管基因靶标的一部分，其中所述单链dna分子包含至少在其长度的一部分上适于通过互补碱基配对与所述单链dna的一部分退火以形成双链dna结构的核苷酸序列，其中所述双链抑制性rna由天然核苷酸组成。
15、根据本发明的一个方面，提供了核酸分子，其包含
16、第一部分，包含双链抑制性核糖核酸(rna)分子，该分子包含有义链和反义链；和
17、第二部分，包含单链脱氧核糖核酸(dna)分子，其中所述单链dna分子的3’端与双链抑制性rna分子的有义链的5’端共价连接，或者其中单链dna分子的3’端与双链抑制性rna分子的反义链的5’共价连接，其特征在于，双链抑制性rna包含编码与心血管疾病相关的心血管基因靶标的一部分的有义核苷酸序列，或其多态性序列(polymorphic sequence)变体，其中所述单链dna分子包含至少在其长度的一部分上适于通过互补碱基配对与所述单链dna的一部分退火以形成包含茎和环结构域的双链dna结构的核苷酸序列，其特征在于，所述核酸分子包含n-乙酰半乳糖胺，并且所述双链抑制性rna由天然核苷酸组成。
18、“多态性序列变体”是有一个、两个、三个或更多个核苷酸发生变化的基因序列。
19、在本发明的优选实施方案中，其中所述单链dna分子的3’端与双链抑制性rna分子的有义链的5’端共价连接。
20、在本发明的优选实施方案中，其中所述单链dna分子的3’端与双链抑制性rna分子的反义链的5’端共价连接。
21、在本发明的优选实施方案中，单链dna分子与所述有义链的5’端和所述反义链的5’端共价连接。
22、在本发明的替代实施方案中，所述单链dna分子与所述有义链的5’端、所述有义链的3’端共价连接。
23、在本发明的优选实施方案中，所述环部分包括包含核苷酸序列gna或gnna的区域，其中每个n独立地代表鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、腺嘌呤(a)或胞嘧啶(c)。
24、在本发明的优选实施方案中，所述环结构域包含g和c核苷酸碱基。
25、在本发明的替代实施方案中，所述环结构域包含核苷酸序列gcgaagc。
26、在本发明的优选实施方案中，所述单链dna分子包含核苷酸序列5’tcacctcatcccgcgaagc 3’(seq id no 387和251)。
27、在本发明的优选实施方案中，所述单链dna分子包含核苷酸序列5’cgaagcgccctactccact 3’(seq id no 130)。
28、在本发明的优选实施方案中，所述单链dna分子包含核苷酸序列5’gcgaagcccctactccact 3’(seq id no 400)。
29、抑制性rna分子包含无需化学修饰的天然核苷酸碱基或由其组成。此外，在本发明的一些实施方案中，其中crook dna分子与所述双链抑制性rna的有义链的3’端连接，反义链至少任选地提供双核苷酸碱基的悬垂(overhang)序列。双核苷酸悬垂序列可以对应于靶标编码的核苷酸，或者是非编码的。双核苷酸悬垂序列可以是任意序列和任意顺序的两个核苷酸，例如uu、aa、ua、au、gg、cc、gc、cg、ug、gu、uc、cu和tt。
30、在本发明的优选实施方案中，所述抑制性rna分子包括包含脱氧胸苷二核苷酸(dtdt)或由其组成的双核苷酸悬垂。
31、在本发明的优选实施方案中，所述dtdt悬垂位于所述反义链的5’端。
32、在本发明的替代优选实施方案中，所述dtdt悬垂位于所述反义链的3’端。
33、在本发明的优选实施方案中，所述dtdt悬垂位于所述有义链的5’端。
34、在本发明的替代优选实施方案中，所述dtdt悬垂位于所述有义链的3’端。
35、在本发明的优选实施方案中，所述有义链和/或所述反义链包含核苷酸间硫代磷酸酯连接。
36、在本发明的优选实施方案中，所述有义链包含核苷酸间硫代磷酸酯连接。
37、优选地，所述有义链的5’和/或3’末端的两个核苷酸包含两个核苷酸间硫代磷酸酯连接。
38、在本发明的优选实施方案中，所述反义链包含核苷酸间硫代磷酸酯连接。
39、优选地，所述反义链的5’和/或3’末端的两个核苷酸包含两个核苷酸间硫代磷酸酯连接。
40、在本发明的替代优选实施方案中，所述单链dna分子包含一个或更多个核苷酸间硫代磷酸酯连接。
41、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含乙烯基膦酸酯修饰。
42、在本发明的优选实施方案中，所述乙烯基膦酸酯修饰是对所述有义rna链的5’末端磷酸酯的修饰。
43、在本发明的优选实施方案中，所述乙烯基膦酸酯修饰是对所述反义rna链的5’末端磷酸酯的修饰。
44、在本发明的优选实施方案中，所述双链抑制性rna分子的长度在10至40个核苷酸之间。
45、在本发明的优选实施方案中，所述双链抑制性rna分子的长度在17至29个核苷酸之间。
46、在本发明的优选实施方案中，所述双链抑制性rna分子的长度为19至21个核苷酸。优选地，长度为19个核苷酸。
47、在本发明的优选实施方案中，所述心血管基因靶标是人脂蛋白(a)。
48、在本发明的替代实施方案中，所述双链抑制性rna分子包含选自由以下组成的组的反义核苷酸序列：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34。
49、在本发明的优选实施方案中，所述双链抑制性rna分子包括包含seq id no:41的反义核苷酸序列和包含seq id no:49的有义核苷酸序列，其中所述单链dna分子与双链抑制性rna分子的有义链的5’端共价连接。
50、在本发明的优选实施方案中，所述双链抑制性rna分子包括包含seq id no:4的反义核苷酸序列和包含seq id no:44的有义核苷酸序列，其中所述单链dna分子与双链抑制性rna分子的反义链的5’端共价连接。
51、在本发明的优选实施方案中，所述双链抑制性rna分子包括包含seq id no:5的反义核苷酸序列和包含seq id no:46的有义核苷酸序列，其中所述单链dna分子与双链抑制性rna分子的反义链的5’端共价连接。
52、在本发明的替代优选实施方案中，所述心血管基因靶标是人载脂蛋白c iii(apoc iii)。
53、优选地，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no：60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78和79。
54、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249和250。
55、优选地，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:50、51、52、53、54、55、56、57、58、80、81、82、83、84、85、86、87、88和89。
56、在本发明的替代优选实施方案中，所述心血管基因靶标是人甘油二酯酰基转移酶2(dgat2)。
57、优选地，所述核酸包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118和119。
58、优选地，所述核酸包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169和170。
59、优选地，所述核酸包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、120、121、122、123、124、125、126、127、128和129。
60、在本发明的优选实施方案中，所述心血管基因靶标是人pcsk9。
61、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、189和190。
62、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209和210。
63、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:255、256、257、258、259、260、261、262、263和264。
64、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:265、266、267、268、269、270、271、272、273和274。
65、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、292、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329和330。
66、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、285和386。
67、在本发明的优选实施方案中，所述心血管基因靶标是人载脂蛋白b。
68、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:499、500、453、502、503、457、505、506、462、508、509、467、511、512、472、514、515、477、517、518、482、520、521、487、523、524和492。
69、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：450、501、455、504、460、507、465、510、470、513、475、516、480、519、485、522、490和525。
70、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含表1中列出的核苷酸序列或多态性序列变体，或由其组成。
71、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含表2中列出的核苷酸序列或多态性序列变体，或由其组成。
72、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含表3中列出的核苷酸序列或多态性序列变体，或由其组成。
73、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含表4中列出的核苷酸序列或多态性序列变体，或由其组成。
74、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含表5中列出的核苷酸序列或多态性序列变体，或由其组成。
75、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含表8中列出的核苷酸序列或多态性序列变体，或由其组成。
76、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含表10中列出的核苷酸序列或多态性序列变体，或由其组成。
77、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含表14中列出的核苷酸序列或多态性序列变体，或由其组成。
78、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含rna链，该rna链包含表15中列出的核苷酸序列或多态性序列变体，或由其组成。
79、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子包含seq id no:388所示的核苷酸序列的19至21个连续核苷酸或由其组成。
80、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子与n-乙酰半乳糖胺共价连接。
81、在本发明的另一个实施方案中，n-乙酰半乳糖胺与所述抑制性rna的反义部分或所述抑制性rna的有义部分连接。
82、优选地，n-乙酰半乳糖胺与所述有义rna的5’末端连接。
83、在本发明的替代实施方案中，n-乙酰半乳糖胺与所述有义rna的3’末端连接。
84、在本发明的替代优选实施方案中，所述n-乙酰半乳糖胺与所述反义rna的3’末端连接。
85、在本发明的优选实施方案中，n-乙酰半乳糖胺是单价的。
86、在本发明的优选实施方案中，n-乙酰半乳糖胺是二价的。
87、在本发明的替代实施方案中，n-乙酰半乳糖胺是三价的。
88、在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子与包含以下结构的分子共价连接：
89、
90、在本发明的替代实施方案中，所述核酸分子与包含以下结构的分子共价连接：
91、
92、在本发明的替代实施方案中，所述核酸分子与包含以下结构的分子共价连接：
93、
94、在本发明的替代实施方案中，所述核酸分子与包含以下结构的分子共价连接：
95、
96、在本发明的替代优选实施方案中，所述核酸分子与包含n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯的分子共价连接。
97、根据本发明的另一方面，提供了药物组合物，其包含至少一种根据本发明的核酸分子。
98、在本发明的优选实施方案中，所述组合物进一步包括药物载体和/或赋形剂。
99、施用时，本发明的组合物以药学上可接受的制剂施用。此类制剂可常规含有药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体和任选的其他治疗剂(如降胆固醇剂)，其可与根据本发明的核酸分子分开施用，或在组合相容的情况下在组合制剂中施用。
100、根据本发明的核酸与其他不同治疗剂的组合可同时施用、依次施用或在不同时间分别给予剂量。
101、本发明的治疗剂可通过任何常规途径施用，包括注射或在一段时间内逐渐输注。施用可以例如是口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、腔内、皮下、透皮或跨上皮的(transepithelial)。
102、本发明的组合物以有效量施用。“有效量”是单独使用或与其他剂量一起使用能产生所需反应的组合物的量。在治疗疾病(如心血管疾病)的情况下，所需的反应是抑制或逆转疾病的进展。这可能只涉及暂时减缓疾病的进展，但更优选地，它涉及永久停止疾病的进展。这可以通过常规方法进行监测。
103、当然，这种量将取决于所治疗的特定病况、病况的严重程度、患者的个体参数(包括年龄、身体状况、体型和体重)、治疗的持续时间、并存疗法(如有)的性质、具体的施用途径以及保健医生的知识和专长范围内的类似因素。这些因素都是本领域普通技术人员所熟知的，只需进行常规实验即可解决。通常优选的是，使用单个组分或其组合的最大剂量，即根据可靠的医学判断得出的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员可以理解，患者可能会出于医学原因、心理原因或几乎任何其他原因而坚持使用较低剂量或可耐受剂量。
104、前述方法中使用的药物组合物优选是无菌的，并含有有效量的根据本发明的核酸分子，其以适合向患者施用的单位重量或体积产生所需的反应。例如，可以通过确定心血管疾病的消退和疾病症状的减轻等来衡量反应。
105、可以根据不同的参数，特别是根据使用的施用方式和受试者的状态，选择向受试者施用的根据本发明的核酸分子的剂量。其他因素包括所需的治疗周期。如果受试者对施加的初始剂量的反应不充分，则可在患者耐受性允许的范围内使用更大剂量(或通过不同的、更局部的递送途径有效地使用更大剂量)。显然，检测根据本发明的核酸的方法有助于确定用于需要治疗的受试者的适当剂量。
106、一般来说，通常将根据标准程序进行配制和施用的本文公开的核酸分子的剂量在1nm-1μm之间。优选地，剂量范围可以是1nm-500nm、5nm-200nm、10nm-100nm。本领域普通技术人员还会知道其他用于施用组合物的方案，其中剂量、注射日程、注射部位、施用方式等均可与上述方案不同。对人类以外的哺乳动物施用组合物(例如，出于试验目的或兽医治疗目的)，应在与上述基本相同的条件下进行。如本文所用，受试者是哺乳动物，优选人类，并包括非人类灵长类动物或适用于表达人脂蛋白(a)的转基因哺乳动物。
107、施用时，本发明的药物制剂以药学上可接受的量和药学上可接受的组合物的形式应用。术语“药学上可接受的”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。此类制剂常规可含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体和任选地其他治疗剂，如他汀类药物。用于医药时，盐应是药学上可接受的，但非药学上可接受的盐也可方便地用于制备其药学上可接受的盐，并且不排除在本发明的范围之外。此类药理和药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。此外，药学上可接受的盐也可以制备成碱金属盐或碱土盐，如钠盐、钾盐或钙盐。
108、如果需要，可将组合物与药学上可接受的载体组合。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质，其适合于向人类施用。本文语境下的术语“药学上可接受的载体”是指天然或合成的有机或无机成分，活性成分与之组合有利于溶解度和/或稳定性等。药物组合物中的组分还能够与本发明的分子共混，以及相互共混，其方式不产生会严重损害所需药效的相互作用。
109、药物组合物可含有合适的缓冲剂，包括乙酸盐；柠檬酸盐；硼酸盐；和磷酸盐。药物组合物还可以任选地含有合适的防腐剂。
110、药物组合物可以方便地以单位剂型呈现，并可以通过制药领域中众所周知的任何方法制备。所有方法都包括将活性剂与构成一种或更多种辅助成分的载体结合的步骤。一般来说，通过将活性化合物与液体载体、细颗粒固体载体或这两者均匀、紧密地结合，然后在必要时对产物进行成形，来制备组合物。适用于口服施用的组合物可以呈现为离散单元，如胶囊、片剂、锭剂，每个单元都含有预定量的活性化合物。
111、适用于肠胃外施用的组合物方便地包含核酸的无菌水性或非水性制剂，该制剂优选地与接受者的血液等渗。这种制剂可根据已知方法使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如，以1,3-丁二醇为溶剂的溶液。可采用的可接受的溶剂有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油(sterile,fixed oils)通常用作溶剂或悬浮介质。出于该目的，可以使用任何温和的(bland)固定油，包括合成的单甘油酯或双甘油酯。此外，脂肪酸如油酸也可用于制备注射剂。适于口服、皮下、静脉内、肌肉内等施用的载体制剂可参见remington’s pharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pa。
112、在本发明的另一个优选实施方案中，所述药物组合物包含至少一种另外的不同的治疗剂。
113、在本发明的优选实施方案中，所述另外的治疗剂是他汀类药物。
114、他汀类药物通常用于控制ldl-c升高的受试者的胆固醇水平。他汀类药物可有效预防和治疗易患心血管疾病和已患心血管疾病的受试者。他汀类药物的典型剂量在5至80mg的范围内，但这取决于该他汀类药物和患有高ldl-c的受试者所需的ldl-c期望降低的水平。然而，他汀类药物的靶标hmg-coa还原酶的表达和合成会对于他汀类药物的施用而发生适应，因此，在产生他汀类药物抗性后，他汀类药物疗法的有益效果只是暂时的或有限的。
115、优选地，所述他汀类药物选自由阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀组成的组。
116、在本发明的优选实施方案中，所述另外的治疗剂是依折麦布。任选地，可以将依折麦布与至少一种他汀类药物(如辛伐他汀)组合。
117、在本发明的替代优选实施方案中，所述另外的治疗剂选自由贝特类(fibrates)、烟酸、消胆胺(cholestyramine)组成的组。
118、在本发明的另外的替代优选实施方案中，所述另外的治疗剂是治疗性抗体，如依洛尤单抗(evolocumab)、伯考赛珠单抗(bococizumab)或阿利西尤单抗(alirocumab)。
119、根据本发明的另一方面，提供了根据本发明的核酸分子或药物组合物，用于治疗或预防患有或易患高胆固醇血症或与高胆固醇血症相关的疾病的受试者。
120、在本发明的优选实施方案中，所述受试者是儿科受试者。
121、儿科受试者包括新生儿(0-28天)、婴儿(1-24个月)、幼儿(2-6岁)和青春期前[7-14岁]儿童。
122、在本发明的替代优选实施方案中，所述受试者是成年受试者。
123、在本发明的优选实施方案中，高胆固醇血症是家族性高胆固醇血症。
124、在本发明的优选实施方案中，家族性高胆固醇血症与脂蛋白(a)表达水平升高有关。
125、在本发明的优选实施方案中，所述受试者对他汀类药物疗法有抗性。
126、在本发明的优选实施方案中，所述与高胆固醇血症相关的疾病选自由以下组成的组：中风预防、高脂血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、冠心病、主动脉狭窄、脑血管疾病、外周动脉疾病、高血压、代谢综合征、ii型糖尿病、非酒精性脂肪酸肝病、非酒精性脂肪性肝炎、伯格氏病、肾动脉狭窄、高脂蛋白血症、脑血管动脉粥样硬化、脑血管疾病和静脉血栓。
127、根据本发明的另一方面，提供了治疗患有或易患高胆固醇血症的受试者的方法，该方法包括施用有效剂量的根据本发明的核酸或药物组合物，从而治疗或预防高胆固醇血症。
128、在本发明的优选方法中，所述受试者是儿科受试者。
129、在本发明的替代优选方法中，所述受试者是成年受试者。
130、在本发明的优选方法中，高胆固醇血症是家族性高胆固醇血症。
131、在本发明的优选方法中，家族性高胆固醇血症与脂蛋白(a)表达水平升高有关。
132、在本发明的优选方法中，所述受试者对他汀类药物疗法有抗性。
133、在本发明的优选方法中，所述与高胆固醇血症相关的疾病选自由以下组成的组：中风预防、高脂血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、冠心病、主动脉狭窄、脑血管疾病、外周动脉疾病、高血压、代谢综合征、ii型糖尿病、非酒精性脂肪酸肝病、非酒精性脂肪性肝炎、伯格氏病、肾动脉狭窄、高脂蛋白血症、脑血管动脉粥样硬化、脑血管疾病和静脉血栓。
134、在本说明书的整个描述和权利要求中，单词“包含(comprise)”和“含有(contain)”以及这两个词的变形，例如“comprising”和“comprises”，意指“包括但不限于”，并无意(也不)排除其他部分、添加剂、组分、整体(integer)或步骤。
135、在本说明书的整个描述和权利要求中，除非上下文另有要求，否则单数形式涵盖复数形式。特别是，在使用不定冠词时，除非上下文另有要求，否则本说明书应理解为既包含复数，也包含单数。
136、结合本发明的一个方面、实施方案或实施例所描述的特征、整体、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文描述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与之不相容。
技术实现思路
1.核酸分子，其包含
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述单链dna分子的3’端与双链抑制性rna分子的有义链的5’端共价连接。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述单链dna分子的3’端与双链抑制性rna分子的反义链的5’端共价连接。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述环结构域包含核苷酸序列gcgaagc。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述单链dna分子包含选自以下组的核苷酸序列：
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，其中所述抑制性rna分子包含含有至少一个脱氧胸苷二核苷酸(dtdt)或由其组成的双核苷酸悬垂。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸分子，其中所述有义链和/或所述反义链包含至少一个核苷酸间硫代磷酸酯连接。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含乙烯基膦酸酯修饰。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子，其中所述双链抑制性rna分子的长度在17至29个核苷酸或19至21个核苷酸之间。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的核酸分子，其中所述心血管基因靶标是人脂蛋白(a)。
11.根据权利要求10所述的核酸分子，其中所述双链抑制性rna分子包含选自由以下组成的组的反义核苷酸序列：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33和34。
12.根据权利要求10所述的核酸分子，其中所述双链抑制性rna分子包括包含seq idno:41的反义核苷酸序列和包含seq id no:49的有义核苷酸序列，其中所述单链dna分子与双链抑制性rna分子的有义链的5’端共价连接。
13.根据权利要求10所述的核酸分子，其中所述双链抑制性rna分子包括包含seq idno:4的反义核苷酸序列和包含seq id no:44的有义核苷酸序列，其中所述单链dna分子与双链抑制性rna分子的反义链的5’端共价连接。
14.根据权利要求10所述的核酸分子，其中所述双链抑制性rna分子包括包含seq idno:5的反义核苷酸序列和包含seq id no:46的有义核苷酸序列，其中所述单链dna分子与双链抑制性rna分子的反义链的5’端共价连接。
15.根据权利要求1至9中任一项所述的核酸分子，其中所述心血管基因靶标是人载脂蛋白c iii(apo c iii)。
16.根据权利要求15所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含rna链，所述rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78和79。
17.根据权利要求15所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含rna链，所述rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249和250。
18.根据权利要求15所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含rna链，所述rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:50、51、52、53、54、55、56、57、58、80、81、82、83、84、85、86、87、88和89。
19.根据权利要求1至9中任一项所述的核酸分子，其中所述心血管基因靶标是人甘油二酯酰基转移酶2(dgat2)。
20.根据权利要求19所述的核酸分子，其中所述核酸包含rna链，所述rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118和119。
21.根据权利要求19所述的核酸分子，其中所述核酸包含rna链，所述rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169和170。
22.根据权利要求19所述的核酸分子，其中所述核酸包含rna链，所述rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、120、121、122、123、124、125、126、127、128和129。
23.根据权利要求1至9中任一项所述的核酸分子，其中所述心血管基因靶标是人pcsk9。
24.根据权利要求23所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含rna链，所述rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、189、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209和210。
25.根据权利要求23所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含rna链，所述rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209和210。
26.根据权利要求1至9中任一项所述的核酸分子，其中所述心血管基因靶标是人载脂蛋白b。
27.根据权利要求26所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含rna链，所述rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seq id no:499、500、453、502、503、457、505、506、462、508、509、467、511、512、472、514、515、477、517、518、482、520、521、487、523、524和492。
28.根据权利要求26所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含rna链，所述rna链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：450、501、455、504、460、507、465、510、470、513、475、516、480、519、485、522、490和525。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子与n-乙酰半乳糖胺共价连接。
30.药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1至29中任一项所述的核酸分子。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述组合物包含至少一种另外的治疗剂。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的核酸分子或药物组合物，其用于治疗或预防患有或易患高胆固醇血症或与高胆固醇血症相关的疾病的受试者。
