本发明涉及一种具有对霜霉病的大范围的小种显示抗性的基因的菠菜植物及其制造方法。本技术要求2021年11月1日在日本提交申请的特愿2021-178897号优先权，本文引用其内容。
背景技术：
1、菠菜(spinacia oleracea l.)是苋科菠菜属的一年生草本植物或多年生草本植物，原产于亚洲西部并广泛栽培，被认为于江户时代自中国传入日本。菠菜主要食用基生叶(莲座状(ロゼット状))，维生素类或铁、钙成分的含量在蔬菜中也是特别高的，营养价值极高。近年来，由于其营养素和简便性方面，嫩叶的市场以欧美为中心迅速扩大。从而，菠菜被定位为重要蔬菜之一。
2、通常，植物品种有常规种和杂种第一代(以下，称为“f1”)品种，主要作物中普及f1品种。f1品种由于杂种优势(ヘテロシス)而生长旺盛。由此，f1品种具有生长快、产量能力提高等巨大的优势，进一步，亦能够期待抗病虫害的能力、耐寒性/耐暑性等适应环境的能力提高。另外，由于f1品种为杂合的且为相同的基因型，因而表型显示出极高的均一性。因此，农产品的可销售性提高。进一步，f1品种的双亲能够积累显性基因所支配的有用性状，因此能够进行快速的育种。由于具有如上所述的优势，使得f1品种在主要作物中占据了栽培品种的主流。被视为可食用的菠菜在二十世纪六十年代以前一直以常规种为中心，而在二十世纪七十年代以后迅速推进f1化，目前大部分为f1品种。
3、另一方面，使菠菜受损害的病害之一有由作为丝状菌的菠菜霜霉分化型病菌(peronospora effusa)(别名：peronospora farinosa f.sp.spinaciae，(pfs))引起的霜霉病。霜霉病是使产量、品质蒙受非常严重的损害的最主要的病害，一旦发生则危害便会迅速扩大。作为霜霉病的对策，也尝试了耕种性的病原菌的防治或者使用农药等的化学性病原菌的防治，但从对于环境的影响、栽培劳动力或成本等方面出发，使用抗性品种是最有效的方法。
4、霜霉病因小种分化快而为人所知，侵袭抗性品种的新的小种不断出现，迄今为止也确认了很多被认为具有抗性的品种发病的事例。菠菜霜霉病国际工作组(iwgp)为由接受美国的阿肯色大学以及加利福尼亚大学的支援的种苗公司、和荷兰的荷兰园艺检验局(naktuinbouw)组成的联合团体，监视新型的霜霉病的小种的出现与扩散，并决定正式的命名。自1824年报告了最初的霜霉病的出现以后，迄今为止已经命名了十九个小种(非专利文献1)。
5、为了应对新的小种的连续出现，在菠菜的育种方面，新型抗性材料的搜索是非常重要的。不仅是在栽培种方面，在野生种方面也进行对霜霉病具有抗性的遗传材料的搜索。例如，已由荷兰遗传资源中心(cgn)于2008年对野生种菠菜的突厥菠菜(spinaciaturkestanica)、于2011年对野生种菠菜的四蕊菠菜(spinacia tetrandra)进行了对霜霉病的抗性遗传材料的搜索。另外，correll等人于2011年发表了六种被称为rpf的基因控制已知的霜霉病抗性(非专利文献2)。进一步，作为霜霉病抗性基因，已报告有rpf1～rpf10、rpf11(专利文献1)、rpf12(专利文献2)、rpf13(专利文献3)、rpf14(专利文献4)、rpf15(专利文献5)、r6(专利文献6)、r15(专利文献7)等。通过将来源于野生种菠菜的霜霉病抗性基因导入至栽培种菠菜的菠菜(spinacia oleracea l.)中，能够培育霜霉病抗性高的菠菜(专利文献8)。
6、rpf基因为位于被称为rpf基因座的一个基因座上的多个等位基因、或者紧密连锁的多个基因，在f1品种中，通过具有两个等位基因而显示出广泛的抗性(非专利文献3、专利文献5)。例如，rpf1基因、rpf2基因以及rpf3基因位于3号染色体上(非专利文献3)、rpf15基因也位于3号染色体上(专利文献5)。另外，专利文献8中所记载的霜霉病抗性基因虽然被认为位于连锁群6上，但据序列信息显示，其实际上位于3号染色体上(专利文献5)。
7、在霜霉病抗性基因座中，根据其结构，大致分为alpha wolf基因以及beta wolf基因的一个或者两个wolf基因邻接存在(专利文献9)。alpha wolf基因以及beta wolf基因包含赋予各自特定的抗性谱的多个等位基因，并且其各自的wolf基因的lrr结构域序列以及各自的基因型对霜霉病小种的抗性模式已被公开。理论上，通过具有不同的抗性模式的wolf基因的组合，能够设计期望的抗性模式。但是，在现有的杂交育种中，实际上不可能将非常紧密地连锁的基因进行任意组合。
8、除此之外，通过转化自外部导入霜霉病抗性基因(gmo)、或者修饰内源性基因(基因编辑)，也能够制作赋予期望的抗性模式的突变体。但是，存在的问题是：通过gmo或者基因修饰选育的作物尚未被大众广泛接受。
9、已报告霜霉病抗性基因p10位于1号染色体上，并且对pfs1、pfs2、pfs3、pfs4、pfs5、pfs6、pfs7、pfs8、pfs9、pfs10、pfs11、pfs12、pfs13、pfs14、pfs15和pfs16显示抗性。但是，由p10基因赋予的抗性仅在为纯合时表达，并且其抗性程度为中等(专利文献10)。因此，推测使用p10基因的抗性品种育成不仅比使用显性的抗性基因的育成困难，而且耐性的程度在实用方面也称不上充分。另外，已报告四蕊菠菜品系cgn120251在4号染色体中具有霜霉病抗性基因，对pfs4、pfs7、pfs9、pfs10、pfs11、pfs12、pfs13、pfs14、pfs15、pfs16和pfs17显示抗性(专利文献11)。
10、市售菠菜的品种也有常规种，但大部分为利用雌系与雄系获得的杂种。雄性与雌性的亲本一般具有彼此不同的抗性基因。例如，杂交品种仙女(アンドロメダ，nunhems公司制造)对pfs1～pfs12和pfs14具有耐性。对pfs1、pfs3、pfs5、pfs8、pfs9、pfs11、pfs12、pfs14的抗性由亲本的一方的抗性基因所赋予，对pfs1～pfs10的抗性由亲本的另一方的抗性基因所赋予(专利文献4)。
11、现有技术文献
12、专利文献
13、专利文献1：美国专利第10258001号说明书
14、专利文献2：美国专利第10258002号说明书
15、专利文献3：国际公开第2015/036378号
16、专利文献4：国际公开第2019/145446号
17、专利文献5：国际公开第2019/145447号
18、专利文献6：专利第6457269号公报
19、专利文献7：美国专利第9974276号说明书
20、专利文献8：专利第6684207号公报
21、专利文献9：国际公开第2018/059651号
22、专利文献10：美国专利申请公开第2019/0104700号说明书
23、专利文献11：国际公开第2020/239215号
24、非专利文献
25、非专利文献1：plantum，“denomination of pe：18和19，two new races of downymildew in spinach”，[线上]，2021年4月15日，[2021年10月4日检索]网页<url：https://plantum.nl/denomination-of-pe-18-and-19-two-new-races-of-downy-mildew-in-spinach/>
26、非专利文献2：correll等，european journal of plant pathology，2011，第129卷，第193-205页。
27、非专利文献3：feng等，euphytica，2018，214：174。
28、非专利文献4：international seed federation，“differential setsperonospora farinosa f.sp.spinaciae(p.effusa)”，2018，<网页>http://www.worldseed.org/wp-content/uploads/2018/04/spinach-downy-mildew_april2018.pdf
29、非专利文献5：iwata and ninomiya，breeding science，2006，第56(4)卷，第371-377页。
技术实现思路
1、发明要解决的技术问题
2、目前并不知晓对已命名的全部pfs小种(pfs1～pfs19)、ua1014型、be2105b型和pv2144型赋予抗性的单一的抗性基因。因此，为了使用已知的抗性基因来获得对已知的全部pfs小种的抗性，需要组合多个抗性基因。
3、本发明的目的在于提供一种至少对pfs1～pfs19、ua1014型、be2105b型和pv2144型中的全部赋予耐性的单一的显性霜霉病抗性基因。
4、用于解决技术问题的技术手段
5、本技术发明人们为了解决上述问题进行了研究，结果发现：在四蕊菠菜品系rnr140003的3号染色体上存在至少对pfs1～pfs19、ua1014型、be2105b型和pv2144型中的全部显示抗性的显性新型的霜霉病抗性基因，并将该基因命名为rpf-sk1基因。进一步发现：通过进行具有该霜霉病抗性基因的野生种菠菜与栽培种菠菜的种间杂交获得具有霜霉病抗性的f1个体，对该f1个体进一步重复进行与栽培种菠菜的杂交，由此能够育成具备该霜霉病抗性基因带来的霜霉病抗性以及接近栽培种的性状的菠菜植物，从而完成了本发明。
6、也就是说，本发明如下所述。
7、[1]一种霜霉病抗性菠菜植物，其在至少一个等位基因中具有霜霉病抗性rpf-sk1基因，所述rpf-sk1基因，
8、(a)在chr3_1215815上鉴定的snp是胞嘧啶，
9、(b)在chr3_1215855上鉴定的snp是胸腺嘧啶，
10、(c)在chr3_1216014上鉴定的snp是胞嘧啶，
11、(d)在chr3_1216093上鉴定的snp是鸟嘌呤，在chr3_1216094上鉴定的snp是鸟嘌呤，并且在chr3_1216095上鉴定的snp是腺嘌呤，
12、(e)在chr3_1216288上鉴定的snp是腺嘌呤，或者
13、(f)在chr3_1216291上鉴定的snp是鸟嘌呤。
14、[2]所述[1]的霜霉病抗性菠菜植物，其中，所述rpf-sk1基因为纯合的或者杂合的。
15、[3]所述[1]或[2]的霜霉病抗性菠菜植物，其至少对霜霉病的小种pfs1、pfs2、pfs3、pfs4、pfs5、pfs6、pfs7、pfs8、pfs9、pfs10、pfs11、pfs12、pfs13、pfs14、pfs15、pfs16、pfs17、pfs18、pfs19和ua1014型具有抗性，以及对ua1014型所表现的小种具有抗性。
16、[4]所述[1]至[3]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物，其至少对霜霉病的be2105b型和pv2144型具有抗性。
17、[5]所述[1]至[4]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物，其中，所述霜霉病抗性菠菜植物来源于四蕊菠菜和栽培种菠菜的种间杂种植物。
18、[6]所述[1]至[5]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物，其具有来源于保藏号fermbp-22426限定的植物的霜霉病抗性。
19、[7]所述[1]至[6]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物，其具有至少一种以上的所述rpf-sk1基因以外的霜霉病抗性基因。
20、[8]一种霜霉病抗性菠菜植物，其为保藏号ferm bp-22426限定的霜霉病抗性菠菜植物、以所述霜霉病抗性菠菜植物为亲本获得的杂种植物、或其后代。
21、[9]一种菠菜植物的霜霉病抗性的预测方法，其中，调查受验菠菜植物的选自由chr3_1215815、chr3_1215855、chr3_1216014、chr3_1216093、chr3_1216094、chr3_1216095、chr3_1216288和chr3_1216291所组成的组中的一种以上的基因型，在至少一个等位基因中，
22、(a)在chr3_1215815上鉴定的snp是胞嘧啶，
23、(b)在chr3_1215855上鉴定的snp是胸腺嘧啶，
24、(c)在chr3_1216014上鉴定的snp是胞嘧啶，
25、(d)在chr3_1216093上鉴定的snp是鸟嘌呤，在chr3_1216094上鉴定的snp是鸟嘌呤，并且在chr3_1216095上鉴定的snp是腺嘌呤，
26、(e)在chr3_1216288上鉴定的snp是腺嘌呤，或者
27、(f)在chr3_1216291上鉴定的snp是鸟嘌呤的情况下，
28、预测所述受验菠菜植物具有霜霉病抗性的可能性高。
29、[10]一种霜霉病抗性菠菜植物的筛选方法，其中，调查受验菠菜植物的选自由chr3_1215815、chr3_1215855、chr3_1216014、chr3_1216093、chr3_1216094、chr3_1216095、chr3_1216288和chr3_1216291所组成的组中的一种以上的基因型，在至少一个等位基因中，
30、(a)在chr3_1215815上鉴定的snp是胞嘧啶，
31、(b)在chr3_1215855上鉴定的snp是胸腺嘧啶，
32、(c)在chr3_1216014上鉴定的snp是胞嘧啶，
33、(d)在chr3_1216093上鉴定的snp是鸟嘌呤，在chr3_1216094上鉴定的snp是鸟嘌呤，并且在chr3_1216095上鉴定的snp是腺嘌呤，
34、(e)在chr3_1216288上鉴定的snp是腺嘌呤，或者
35、(f)在chr3_1216291上鉴定的snp是鸟嘌呤的情况下，
36、选择该受验菠菜植物作为霜霉病抗性菠菜植物。
37、[11]一种霜霉病抗性菠菜植物的制造方法，其具有以下步骤：
38、第一杂交步骤，将具有rpf-sk1基因的菠菜植物和任意的菠菜植物进行杂交；
39、第二杂交步骤，针对通过所述第一杂交步骤获得的f1个体，进行自交、回交或者与不同于所述第一杂交步骤中使用的亲本的菠菜植物进行种间杂交或者种内杂交，获得分离族群；以及
40、选择步骤，从所述分离族群中选择具有rpf-sk1基因的菠菜植物。
41、[12]所述[11]的霜霉病抗性菠菜植物的制造方法，其中，所述任意的菠菜植物、或者所述第二杂交步骤中的种间杂交或者种内杂交所使用的亲本为具有至少一种以上的所述rpf-sk1基因以外的霜霉病抗性基因的菠菜植物。
42、[13]所述[1]至[8]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物的植物体的一部分。
43、[14]所述[1]至[8]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物的叶。
44、[15]所述[1]至[8]中任一项的霜霉病抗性菠菜植物的种子。
45、[16]一种用于选择具有rpf-sk1基因的菠菜植物的试剂盒，其包括用于pcr扩增包括受验菠菜植物的chr3_1215815至chr3_1216291的区域的正向引物和反向引物。
46、发明的效果
47、根据本发明，提供一种对广泛的小种显示抗性的霜霉病抗性菠菜植物。
48、另外，通过将本发明所涉及的菠菜植物作为亲本，能够育成对广泛的小种显示抗性的新型菠菜品系。
1.一种霜霉病抗性菠菜植物，其在至少一个等位基因中具有霜霉病抗性rpf-sk1基因，
2.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其中，所述rpf-sk1基因为纯合的或者杂合的。
3.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其至少对霜霉病的小种pfs1、pfs2、pfs3、pfs4、pfs5、pfs6、pfs7、pfs8、pfs9、pfs10、pfs11、pfs12、pfs13、pfs14、pfs15、pfs16、pfs17、pfs18、pfs19和ua1014型所表现的小种具有抗性。
4.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其至少对霜霉病的be2105b型和pv2144型所表现的小种具有抗性。
5.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其中，所述霜霉病抗性菠菜植物来源于四蕊菠菜和栽培种菠菜的种间杂种植物。
6.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其具有来源于保藏号ferm bp-22426限定的植物的霜霉病抗性。
7.根据权利要求1所述的霜霉病抗性菠菜植物，其具有至少一种以上的所述rpf-sk1基因以外的霜霉病抗性基因。
8.一种霜霉病抗性菠菜植物，其为保藏号ferm bp-22426限定的霜霉病抗性菠菜植物、以所述霜霉病抗性菠菜植物为亲本获得的杂种植物、或其后代。
9.一种菠菜植物的霜霉病抗性的预测方法，其中，调查受验菠菜植物的选自由chr3_1215815、chr3_1215855、chr3_1216014、chr3_1216093、chr3_1216094、chr3_1216095、chr3_1216288和chr3_1216291所组成的组中的一种以上的基因型，在至少一个等位基因中，
10.一种霜霉病抗性菠菜植物的筛选方法，其中，调查受验菠菜植物的选自由chr3_1215815、chr3_1215855、chr3_1216014、chr3_1216093、chr3_1216094、chr3_1216095、chr3_1216288和chr3_1216291所组成的组中的一种以上的基因型，在至少一个等位基因中，
11.一种霜霉病抗性菠菜植物的制造方法，其具有以下步骤：
12.根据权利要求11所述的霜霉病抗性菠菜植物的制造方法，其中，所述任意的菠菜植物、或者所述第二杂交步骤中的种间杂交或者种内杂交所使用的亲本为具有至少一种以上的所述rpf-sk1基因以外的霜霉病抗性基因的菠菜植物。
13.根据权利要求1至8中任一项所述的霜霉病抗性菠菜植物的植物体的一部分。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的霜霉病抗性菠菜植物的叶。
15.根据权利要求1至8中任一项所述的霜霉病抗性菠菜植物的种子。
16.一种用于选择具有rpf-sk1基因的菠菜植物的试剂盒，其包括用于pcr扩增包括受验菠菜植物的chr3_1215815至chr3_1216291的区域的正向引物和反向引物。
