本公开涉及一种使用阴离子交换色谱高分辨分离包含核酸的样品的方法。本公开还涉及一种使用阴离子交换色谱确定核酸的一种或多种量热特性的方法。
背景技术：
1、mrna，即在翻译(即蛋白质制造)过程期间由细胞内的核糖体读取的dna的转录形式，代表一类新的先进医药产品。例如，mrna疫苗最近已用于全世界数百万人的抗sars-cov-2免疫。随着医学的进一步发展并且mrna和其他核酸越来越多地用于医药产品中，例如作为药物候选物，对于用于表征核酸的生物物理特性的灵敏的和提供信息的方法的需要应运而生。
2、由于核酸的糖-磷酸骨架中的重复磷酸基团，核酸是带负电荷的。阴离子交换色谱是用于分离带负电荷的分析物的色谱技术。迄今为止，已经公开了非常少的核酸、特别是rna的分析规模阴离子交换分离。kanavarioti,scientific reports 1019(2019)公开了rna的分析规模阴离子交换分离的几个实例中的一些。kanavarioti公开了使用膜状颗粒固定相以及柱温10℃和ph 12或柱温60℃和中性ph进行的阴离子交换分离。kanavarioti中使用的分离条件，即相对高的温度或非常高的ph，对于分离含核酸样品同时还保持核酸从而可以最佳分析完整核酸的异质性不太可能是理想的。因此，存在对于用于分离包含核酸的样品的改进方法的需要。本公开的发明人开发了两种这样的方法，它们在本文中公开。
3、本公开的发明人还开发了一种使用阴离子交换色谱确定核酸的一种或多种量热特性的方法。所述方法提供了用于确定核酸的量热特性的差示扫描量热法(dsc)的替代方法。
技术实现思路
1、根据本发明，提供了一种用于分离包含核酸的样品的方法，所述方法包括：
2、(a)将包含核酸的样品加载到阴离子交换柱上；和
3、(b)使用盐梯度从所述阴离子交换柱上洗脱所述样品，
4、其中洗脱步骤中使用的流动相包含温和离子对阳离子，并且
5、其中所述阴离子交换柱的柱温大于30℃。
6、优选地，所述盐梯度由包含所述温和离子对阳离子的盐产生。
7、有利地，所述盐梯度由非离子对盐、优选含氯化物或溴化物的盐产生，其中所述温和离子对阳离子的浓度在整个洗脱步骤中保持恒定。优选地，所述温和离子对阳离子的浓度是10至2,000mm、10至1,000mm或10至500mm。
8、当所述盐梯度由非离子对盐产生并且所述温和离子对阳离子的浓度在整个洗脱步骤中保持恒定时，优选的是柱温不超过50℃，并且更优选的是其不超过45℃。
9、方便地，所述盐梯度由以下产生：包含所述温和离子对阳离子的盐；和非离子对盐，优选含氯化物或溴化物的盐。
10、优选地，所述核酸是rna。更优选地，所述核酸是mrna。
11、有利地，所述方法使用至少两个流动相，且任选地三个流动相，其中所述流动相用碱性或两性离子缓冲剂缓冲。
12、方便地，所述缓冲剂选自tris、bis-tris丙烷、mes和hepes，尽管可以同等地采用其他碱性或两性离子缓冲剂。
13、优选地，所述缓冲剂是tris。
14、有利地，所述温和离子对阳离子是含氮的。
15、方便地，所述温和离子对阳离子是四甲基铵。在本发明的优选方面，包含所述温和离子对阳离子的盐是四甲基氯化铵。在本发明的一些方面，包含所述温和离子对阳离子的盐是替代性含四甲基铵阳离子的盐。
16、优选地，所述阴离子交换柱的柱温是40℃至60℃。在本发明的方面中，其中在所述盐梯度中使用的盐是四甲基氯化铵，所述柱温优选是40℃。
17、有利地，所述方法使用至少两个流动相，且任选地三个流动相，其中所述流动相具有6.5至10的ph。优选地，所述流动相具有7至9的ph。
18、方便地，所述方法使用至少两个流动相，且任选地三个流动相，其中所述至少两个流动相中的一个或多个包含至少一种另外的温和离子对阳离子。优选地，所述至少一种另外的温和离子对阳离子选自四甲基铵、三乙基铵、二异丙基乙基铵或其组合。
19、根据本发明的另一个方面，提供了一种用于确定核酸的一种或多种量热特性的方法，所述方法包括：
20、a)将包含核酸的样品加载到阴离子交换柱上；
21、b)在第一柱温下从所述阴离子交换柱上洗脱所述样品以生成第一色谱图；
22、c)对多个另外的柱温重复步骤(a)和(b)以生成相应的多个另外的色谱图；以及
23、d)比较在不同柱温下获得的色谱图以确定所述核酸的一种或多种量热特性。
24、优选地，步骤(c)包括对于至少3个另外的柱温重复步骤(a)和(b)。
25、有利地，步骤(d)包括比较第一色谱图中由核酸生成的峰的峰面积与多个另外的色谱图中的每一个中的相应峰的峰面积。
26、方便地，步骤(d)还包括绘制峰面积或相对峰面积相对于柱温的曲线图。
27、优选地，在步骤(b)和步骤(c)之间，所述方法还包括步骤(e)，即在第一柱温下执行空白运行，以生成第一空白运行色谱图；并且步骤(c)包括对于多个另外的柱温重复步骤(a)、(b)和(e)，以生成相应的多个另外的色谱图和另外的空白运行色谱图。
28、有利地，步骤(d)包括比较在每个柱温下生成的色谱图与空白运行色谱图，以确定对于每个柱温核酸的遗留％，并且比较对于每个柱温的遗留％。
29、方便地，步骤(d)还包括绘制遗留％相对于柱温的曲线图。
1.一种用于分离包含核酸的样品的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述盐梯度由包含所述温和离子对阳离子的盐产生。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述盐梯度由非离子对盐、优选含氯化物或溴化物的盐产生，并且其中所述温和离子对阳离子的浓度在整个所述洗脱步骤中保持恒定。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述温和离子对阳离子的浓度是10至2,000mm、10至1,000mm或10至500mm。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述阴离子交换柱的柱温不超过50℃，且优选不超过45℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述盐梯度通过以下产生：包含所述温和离子对阳离子的盐；和非离子对盐、优选含氯化物或溴化物的盐。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸是rna。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述核酸是mrna。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法使用至少两个流动相，并且其中所述流动相用碱性或两性离子缓冲剂缓冲。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述缓冲剂选自tris、bis-tris丙烷、mes和hepes。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述缓冲剂是tris。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述温和离子对阳离子是含氮的。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述温和离子对阳离子是四甲基铵。
14.根据权利要求2所述的方法，其中所述盐梯度由四甲基氯化铵产生。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述阴离子交换柱的柱温是40℃。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法使用至少两个流动相，并且其中所述流动相具有6.5至10的ph。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述流动相具有7至9的ph。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法使用至少两个流动相，并且其中所述至少两个流动相中的一个或多个包含至少一种另外的温和离子对阳离子。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种另外的温和离子对阳离子选自四甲基铵、三乙基铵、二异丙基乙基铵或其组合。
20.一种用于确定核酸的一种或多种量热特性的方法，所述方法包括：
21.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(c)包括对于至少3个另外的柱温重复步骤(a)和(b)。
22.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(d)包括比较所述第一色谱图中由所述核酸生成的峰的峰面积与所述多个另外的色谱图中的每一个中的相应峰的峰面积。
23.根据权利要求22所述的方法，其中步骤(d)还包括绘制峰面积或相对峰面积相对于柱温的曲线图。
24.根据权利要求20所述的方法，其中：
25.根据权利要求24所述的方法，其中步骤(d)包括比较在每个柱温下生成的色谱图与空白运行色谱图，以确定对于每个柱温核酸的遗留％，并且比较对于每个柱温的遗留％。
26.根据权利要求25所述的方法，其中步骤(d)还包括绘制遗留％相对于柱温的曲线图。
