本发明涉及生物。具体地，涉及一种基于cd27分子的car组件设计与应用。
背景技术：
1、嵌合抗原受体(car)是通过对细胞进行基因修饰，来产生肿瘤靶标特异性免疫细胞的最常用方法。car已被引入不同类型的免疫细胞，包括t细胞，nk细胞和巨噬细胞，这些car转导的免疫细胞分别被命名为car-t，car-nk和car-m。嵌合抗原受体通常由三个主要区域组成。首先是抗体(scfv)的单链可变片段，也是与肿瘤细胞外配体结合的结构域。car结构的第二区域包含跨膜结构域和铰链/细胞外间隔物。该区域将car的其他两个组件连接起来，并增强了结构的整体灵活性、稳定性和二聚化性。第三区是细胞质内信号传导域和共刺激分子。该区域负责信号的传输，并且大部分car构造修改都是在该区域完成的，以进一步提高特定car的信号传输能力，并使免疫细胞具有更强的杀伤能力与存续时间。
2、尽管cd28，cd137以及2b4等分子的共刺激域已被广泛应用于基因修饰nk的car载体结构上，本领域仍然需要进一步开发有利于提高car分子杀伤效果的car结构组件，特别是优化car结构中的跨膜结构域和铰链/细胞外间隔物的结构组件。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种基于cd27分子的car组件设计与应用。
2、在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(car)，所述嵌合抗原受体的结构如下式i所示：
3、l-scfv-p-h-tm-c-cd3ζ (i)
4、式中，
5、各“-”独立地为连接肽或肽键；
6、l为任选的信号肽序列；
7、scfv为抗原结合结构域；
8、p为无或肽接头(linker)；
9、h为无或cd27来源的铰链区；
10、tm为跨膜结构域；
11、c为共刺激信号分子；
12、cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列。
13、在另一优选例中，所述的l为选自下组的蛋白的信号肽：cd8、gm-csf、cd4、cd137、或其组合。
14、在另一优选例中，所述的l为cd8来源的信号肽。
15、在另一优选例中，所述的l的氨基酸序列如seq id no:1所示。
16、在另一优选例中，所述scfv为靶向肿瘤抗原的抗体单链可变区序列。
17、在另一优选例中，所述scfv为靶向选自下组抗原的抗体单链可变区序列：cd19、cd20、cd22、cd123、cd47、cd138、cd33、cd30、间皮素(mesothelin)、egfr、gpc3、bcma、erbb2、nkg2d配体、lmp1、epcam、vegfr-1、lewis-y、ror1、claudin18.2、或其组合。
18、在另一优选例中，所述scfv包括一个或多个串联的靶向肿瘤抗原的抗体单链可变区序列。
19、在另一优选例中，所述p为柔性接头。
20、在另一优选例中，所述柔性接头包括选自下组的氨基酸序列：aaa，(g4s)n，(g4s)naaa，其中n为1-3的正整数。
21、在另一优选例中，所述scfv为靶向cd19的抗原结合结构域。
22、在另一优选例中，所述scfv为fmc63，序列如seq id no.:2所示。
23、在另一优选例中，所述的h为选自下组的蛋白的铰链区：cd27、cd8、cd28、cd137、或其组合。
24、在另一优选例中，所述的h为cd27来源的铰链区，长度为5-80个氨基酸；较佳地10-70个氨基酸；更佳地20-50个氨基酸。
25、在另一优选例中，所述cd27来源的铰链区的氨基酸序列如seq id no.:6或seqidno.:7所示。
26、在另一优选例中，所述的tm为选自下组的蛋白的跨膜区：cd28、cd3 epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其组合。
27、在另一优选例中，所述的tm包括cd27或cd28来源的跨膜区。
28、在另一优选例中，所述的tm的氨基酸序列如seq id no.:4或seq id no.:8所示。
29、在另一优选例中，所述的c为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2、或其组合。
30、在另一优选例中，所述的c包括一个或多个共刺激信号分子。
31、在另一优选例中，所述的c包括多个相同或不同的共刺激信号分子。
32、在另一优选例中，所述的c包括cd27来源的共刺激信号分子；和/或cd28来源的共刺激信号分子。
33、在另一优选例中，所述的cd27来源的共刺激信号分子的氨基酸序列如seq idno.:9所示。
34、在另一优选例中，所述的cd28来源的共刺激信号分子的氨基酸序列如seq idno.:5所示。
35、在另一优选例中，所述的car的结构中，h1为cd27来源的铰链区，tm1为cd27来源的跨膜区，和c为cd27来源的共刺激信号分子。
36、在另一优选例中，所述cd3ζ的氨基酸序列如seq id no:10所示。
37、在另一优选例中，所述的car的结构选自下组：
38、l-scfv-p-cd27l h-tm1-c1-cd3ζ(ii)；或
39、l-scfv-p-cd27s h-tm1-c1-cd3ζ(iii)，其中，
40、“-”为连接肽或肽键；scfv为抗原结合结构域；
41、cd27l h为cd27胞外段截断tnfr结构域后的铰链区，
42、cd27s h为cd27胞外段截断tnfr结构域后较短的铰链区，
43、tm1为cd27来源的跨膜区，
44、c1为cd27来源的共刺激信号分子；
45、元件l、cd3ζ如本发明的第一方面所述，p为肽接头。
46、在另一优选例中，所述p的序列为柔性接头，例如选自下组的氨基酸序列：aaa，(g4s)n，(g4s)naaa，其中n为1-3的正整数。
47、在另一优选例中，所述的car的结构选自下组：
48、l-scfv-cd27l h-tm1-c1-cd3ζ(ii)；或
49、l-scfv-cd27s h-tm1-c1-cd3ζ(iii)，其中，
50、“-”为连接肽或肽键；scfv为抗原结合结构域；
51、cd27l h为cd27胞外段截断tnfr结构域后的铰链区，
52、cd27s h为cd27胞外段截断tnfr结构域后较短的铰链区，
53、tm1为cd27来源的跨膜区，
54、c1为cd27来源的共刺激信号分子；
55、元件l、cd3ζ如本发明的第一方面所述。
56、在另一优选例中，所述的cd27s h为相对于cd27(seq id no.26)的选自下组的氨基酸：
57、第126-191位氨基酸、第127-191位氨基酸、第128-191位氨基酸、第129-191位氨基酸、第130-191位氨基酸、第131-191位氨基酸、第132-191位氨基酸、第133-191位氨基酸、第134-191位氨基酸、第135-191位氨基酸、第136-191位氨基酸、第137-191位氨基酸、第138-191位氨基酸、第139-191位氨基酸、第140-191位氨基酸、第141-191位氨基酸、第142-191位氨基酸、第143-191位氨基酸、第144-191位氨基酸、第145-191位氨基酸、第146-191位氨基酸、第147-191位氨基酸、第148-191位氨基酸、第149-191位氨基酸、第150-191位氨基酸、第151-191位氨基酸、第152-191位氨基酸、第153-191位氨基酸、第154-191位氨基酸、第155-191位氨基酸、第156-191位氨基酸、第157-191位氨基酸、第158-191位氨基酸、第159-191位氨基酸、第160-191位氨基酸。
58、在另一优选例中，所述的cd27l h为相对于cd27(seq id no.26)的第125-191位氨基酸。
59、在另一优选例中，所述的cd27l h的氨基酸序列如seq id no.:6所示。
60、在另一优选例中，所述的cd27s h的氨基酸序列如seq id no.:7所示。
61、在另一优选例中，所述car的氨基酸序列如seq id no.:22或23所示。
62、在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明的第一方面所述的嵌合抗原受体。
63、在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。
64、在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明的第二方面所述的核酸分子。
65、在另一优选例中，所述的载体包括dna、rna。
66、在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体、转座子、双链或单链dna、或其组合。
67、在另一优选例中，所述双链或单链dna为基因编辑中用于同源序列重组的双链或单链dna。
68、在另一优选例中，所述双链或单链dna为带有重组同源臂的单链或双链dna，在crisp/cas9基因编辑技术中，将编码所述car分子的基因序列插入到目的细胞(例如ipsc细胞)基因组上的特定基因位点。
69、在另一优选例中，所述的载体包括dna病毒、逆转录病毒载体。
70、在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。
71、在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
72、在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明的第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明的第二方面所述的核酸分子或表达本发明的第一方面所述的嵌合抗原受体。
73、在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞。
74、在另一优选例中，所述细胞为基因工程化的细胞。
75、在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
76、在另一优选例中，所述细胞为car-t细胞和/或car-nk细胞和/或ipsc细胞。
77、在本发明的第五方面，提供了一种制备car-nk细胞或car-t细胞的方法，所述的car-nk细胞或car-t细胞表达本发明的第一方面所述的嵌合抗原受体，包括以下步骤：将本发明的第二方面所述的核酸分子或本发明的第四方面所述的载体转导入nk细胞或t细胞内，从而获得所述car-nk细胞或car-t细胞。
78、在另一优选例中，所述地方法还包括通过ipsc进行诱导分化成ipsc-car-nk或ipsc-car-t细胞。
79、在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的car-t细胞进行功能和有效性检测的步骤。
80、在本发明的第六方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明的第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明的第二方面所述的核酸分子、本发明的第三方面所述的载体、或本发明的第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
81、在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
82、在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。
83、在另一优选例中，所述制剂中所述car-t细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。
84、在本发明的第七方面，提供了一种本发明的第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明的第二方面所述的核酸分子、本发明的第三方面所述的载体、或本发明的第四方面所述的宿主细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
85、在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合；较佳地，所述肿瘤为血液肿瘤。
86、在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、或其组合。
87、在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、头颈部肿瘤、或其组合。
88、在本发明的第八方面，提供了一种用于制备本发明的第四方面所述细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明的第二方面所述的核酸分子、或本发明的第三方面所述的载体。
89、在本发明的第九方面，提供了一种本发明的第四方面所述细胞、或本发明的第六方面所述的制剂的用途，用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。
90、在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明的第四方面所述细胞、或本发明的第六方面所述的制剂。
91、在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
92、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
1.一种嵌合抗原受体(car)，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构如下式i所示：
2.权利要求1所述的car，其特征在于，所述scfv为靶向cd19的抗原结合结构域。
3.权利要求1所述的car，其特征在于，所述的car的结构选自下组：
4.权利要求1所述的car，其特征在于，所述car的氨基酸序列如seq id no.:22或23所示。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的嵌合抗原受体。
6.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求6所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求5所述的核酸分子或表达权利要求1所述的嵌合抗原受体。
8.一种制备car-nk细胞或car-t细胞的方法，其特征在于，所述的car-nk细胞或car-t细胞表达权利要求1所述的嵌合抗原受体，包括以下步骤：将权利要求5所述的核酸分子或权利要求7所述的载体转导入nk细胞或t细胞内，从而获得所述car-nk细胞或car-t细胞。
9.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、或权利要求7所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
10.一种权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、或权利要求7所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
