本发明涉及基因编辑，尤其是涉及一种微型碱基编辑器及其构建方法与应用。
背景技术：
1、crispr/cas9为代表的新型基因编辑技术具有编辑效率高等优势，极大的推动了基因编辑技术的进步。2016年以来，研究者在crispr/cas9、crispr/cas12a(cpf1)的基础上开发出多种dna碱基编辑工具，可在dna水平介导高效精准的点突变，且此过程中不会产生dna双链断裂。目前报道的碱基编辑器主要有两种：胞嘧啶碱基编辑器(cbe，可介导c·g--t·a突变)和腺嘌呤碱基编辑器(abe，可介导a·t--g·c突变)。其中，cbe是将特定的胞嘧啶核苷脱氨酶(cytidine deaminase)与突变型核酸酶(如携带有d10a或突变的spcas9，称为nspcas9；或是功能失活型cas12a，称为dcas12a)以及尿嘧啶糖基化酶抑制因子(ugi)融合，得到的融合蛋白可在sgrna的引导下，介导c·g--t·a突变。abe则是将定向演化后的大肠杆菌来源的腺苷脱氨酶(ectada*)二聚体或单体与突变型核酸酶(如携带有d10a或突变的spcas9，称为nspcas9；或是功能失活型cas12a，称为dcas12a)融合，得到的融合蛋白可在sgrna的引导下，介导a·t--g·c突变。此外，研究者还将特定的胞嘧啶核苷脱氨酶(cytidine deaminase)、定向演化后的大肠杆菌来源的腺苷脱氨酶(ectada*)、突变型核酸酶(如携带有d10a或突变的spcas9，称为ncas9)以及尿嘧啶糖基化酶抑制因子(ugi)融合构建出acbe，得到的融合蛋白可在sgrna的引导下，可介导特定位点中c·g--t·a突变和a·t--g·c突变的同时发生(nat biotechnol,2020.38(7):861-864；bmc biol,2020.18(1):131；nat biotechnol,2020.38(7):856-860；nat biotechnol,2020.38(7):865-869)。现有的abe、cbe和acbe工具主要依赖于crispr/cas9、crispr/cas12a(cpf1)系统，这两种系统体积过大，cas9和cas12a的蛋白均接近或超过1000个氨基酸，限制了其应用前景。
2、近年来，研究者发现多种新的crispr系统如casd12f、cas12j、tnpb等，其大小仅为400～700氨基酸。此外，研究者还发现新型的iscb系统，iscb系统与cas9系统存在同源性。以上新型crispr或类crispr系统在哺乳动物细胞内具有明显的dna切割活性[1-6]，因此有望用于碱基编辑器小型化研究。有研究者利用失活型un1casd12f1(简称为dcasd12f)构建出功能性的小型化abe(简称为miniabes)，但其碱基编辑活性不足10％，难以满足科研和临床应用的需求。目前微型化的cbe(称为minicbes)工具依然缺少研究。
3、此外iscb系统在哺乳动物细胞中的dna切割活性依然偏低，且grna长度长，仍然有改进的空间。
4、1.karvelis,t.et al.pam recognition by miniature crispr-casd12fnucleases triggers programmable double-stranded dna target cleavage.nucleicacids research 48,5016-5023(2020).
5、2.kim,d.y.et al.efficient crispr editing with a hypercompact casd12f1and engineered guide rnas delivered by adeno-associated virus.naturebiotechnology(2021).
6、3.xu,x.s.et al.engineered miniature crispr-cas system for mammaliangenome regulation and editing.mol cell 81,4333-+(2021).
7、4.karvelis,t.et al.transposon-associated tnpb is a programmable rna-guided dna endonuclease.nature(2021).
8、5.altae-tran,h.et al.the widespread is200/is605 transposon familyencodes diverse programmable rna-guided endonucleases.science 374,57-65(2021).
9、6.wu,z.et al.programmed genome editing by a miniature crispr-casd12fnuclease.nat chem biol 17,1132-1138(2021).
技术实现思路
1、为改进ogeiscb的dna切割活性，本发明对grna进行改造，改造后的三种grna骨架均能介导ogeiscb在哺乳动物细胞中发挥dna切割的活性，三种grna骨架分别命名为grna1.0(m1，骨架序列如seq id no.4)、grna2.0(m1+m2，骨架序列如seq id no.5)、grna3.0(m1+m2+m3，骨架序列如seq id no.6)且grna3.0具有最优活性。。
2、为开发微型化的碱基编辑器abe、cbe和acbe(统称为ogebes)，本发明提供一种碱基编辑器及其构建方法与应用。
3、本发明中碱基编辑器主要是一些产生基因点突变的融合蛋白。
4、本发明通过将胞苷脱氨酶/脱氧腺苷脱氨酶及突变体融合于以nogeiscb为代表的突变型小型核酸酶的c-末端，得到新融合蛋白。
5、本发明开发出微型化的碱基编辑器，可有效实现c-t单碱基替换和a-g单碱基替换。根据脱氨酶的不同，新构建的碱基编辑器还具有不同的活性窗口。本发明能有效拓宽单碱基编辑工具的应用。
6、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
7、第一方面，本发明提供一种改造的ogeiscb的grna，改造的ogeiscb的grna选自以下中的一种：
8、grna1.0，骨架序列如seq id no.4所示，
9、grna2.0，骨架序列如seq id no.5所示，
10、grna3.0，骨架序列如seq id no.6所示。
11、改造的ogeiscb的grna优选为grna3.0，骨架序列如seq id no.6所示。
12、为改进ogeiscb的dna切割活性，本发明对grna进行改造，改造后的三种grna骨架均能介导ogeiscb在哺乳动物细胞中发挥dna切割的活性，三种grna骨架分别命名为grna1.0(m1，骨架序列如seq id no.4)、grna2.0(m1+m2，骨架序列如seq id no.5)、grna3.0(m1+m2+m3，骨架序列如seq id no.6)且grna3.0具有最优活性。
13、第二方面，本发明提供一种碱基编辑器，为将胞苷脱氨酶或脱氧腺苷脱氨酶置于突变型核酸酶nogeiscb的c-末端融合位点形成的融合蛋白ogebes。其中，nogeiscb是ogeiscb的d61a突变体，ogeiscb的氨基酸序列如seq id no.1所示。
14、在本发明的一个实施方式中，所述脱氧腺苷脱氨酶选择为tada-8e或tada-8e突变体。
15、在本发明的一个实施方式中，提供一种具体的碱基编辑器，具体为在nogeiscb的c-末端融合一个或多个tada-8e或tada-8e突变体后形成的融合蛋白。
16、在本发明的一个实施方式中，提供一种具体的碱基编辑器，具体为融合蛋白ogeabes-8e(106w)，其是将tada-8e(106w)置于nogeiscb的c-末端融合形成的融合蛋白。融合蛋白ogeabes-8e的氨基酸序列如seq id no.7所示。
17、在本发明的一个实施方式中，提供一种具体的碱基编辑器，具体为融合蛋白ogeabes-2-8e(106w)，融合蛋白ogeabes-2-8e(106w)是指在nogeiscb的c-末端融合tada-8e-tada-8e后形成的融合蛋白。融合蛋白ogeabes-2-8e(106w)氨基酸序列如seq id no.8所示。
18、在本发明的一个实施方式中，提供一种具体的碱基编辑器，具体为融合蛋白ogeabes-8e突变体，融合蛋白ogeabes-8e突变体是指在nogeiscb的c-末端融合tada-8e突变体后形成的融合蛋白。其中，tada-8e突变体优选tada-8e的v106w、v28g-a48g-i49a-v82t-n108y突变。进一步地，tada-8e突变体优选tada-8e的v28g-a48g-i49a-v82t-n108y突变。其中，在nogeiscb的c-末端融合tada-8e的v28g-a48g-i49a-v82t-n108y突变体后形成的融合蛋白，其氨基酸序列如seq id no.10所示。
19、上述类似“v106w”的表述中，106表示tada-8e中第106位氨基酸位点，v表示tada-8e中第106位氨基酸位点突变前的氨基酸，w表示tada-8e中第106位氨基酸位点突变后的氨基酸，v、w均为氨基酸的缩写表达方式，即v106w表示第106位氨基酸位点由缬氨酸突变为色氨酸；上文或下文中其他类似“v106w”的表达方式均做与此相似的解释，即a48g表示第48位氨基酸位点由丙氨酸突变为甘氨酸。v28g-a48g-i49a-v82t-n108y表示在第28位氨基酸位点由氨基酸v突变为g，并且在第48位氨基酸位点由氨基酸a突变为g，第49位氨基酸位点由氨基酸i突变为a，第82位氨基酸位点由氨基酸v突变为t，第108位氨基酸位点由氨基酸n突变为y，其他做类似解释。其中tada-8e为定向演化后的大肠杆菌来源的腺苷脱氨酶(tada-8e)(nat biotechnol,2020.38(7):883-891)，在专利cn 114045277a中也有记载。
20、在本发明的一个实施方式中，所述脱氧腺苷脱氨酶选择为tada*或tada*突变体。
21、在本发明的一个实施方式中，提供一种具体的碱基编辑器，具体为融合蛋白ogeabes-tada*(82g)，其是将tada*(82g)置于nogeiscb的c-末端融合形成的融合蛋白。融合蛋白ogeabes-tada*(82g)的氨基酸序列如seq id no.9所示。
22、在本发明的一个实施方式中，提供一种具体的碱基编辑器，具体为融合蛋白ogeabes-tada*突变体，融合蛋白ogeabes-tada*突变体是指在nogeiscb的c-末端融合tada*突变体后形成的融合蛋白。其中，tada*突变体优选tada*的v82g突变。
23、在本发明的一个实施方式中，所述胞苷脱氨酶选择为apobec3a突变体。
24、在本发明的一个实施方式中，提供一种具体的碱基编辑器，具体为融合蛋白ogecbes-3a130，融合蛋白ogecbes-3a130是指在nogeiscb的c-末端融合apobec3a突变体后，获得的融合蛋白，其中，融合蛋白ogecbes-3a130的氨基酸序列如seq id no.11所示。
25、在本发明的一个实施方式中，提供一种具体的碱基编辑器，具体为融合蛋白ogecbes-3a(yaf)，融合蛋白ogecbes-3a(yaf)是指在nogeiscb的c-末端融合apobec3a突变体后，获得的融合蛋白，其中，融合蛋白ogecbes-3a(yaf)的氨基酸序列如seq id no.12所示。
26、在本发明的一个实施方式中，提供一种具体的碱基编辑器，具体为融合蛋白ogecbes-ea3a-rl1，融合蛋白ogecbes-ea3a-rl1是指在nogeiscb的c-末端融合apobec3a突变体后，获得的融合蛋白，其中，融合蛋白ogecbes-ea3a-rl1的氨基酸序列如seq id no.13所示。
27、第三方面，本发明提供所述碱基编辑器的构建方法，包括以下步骤：将胞苷脱氨酶或脱氧腺苷脱氨酶和nogeiscb的c-末端融合，构建得到碱基编辑器。
28、第四方面，本发明提供所述碱基编辑器的应用，所述碱基编辑器，作为胞嘧啶碱基编辑器cbe、腺嘌呤碱基编辑器abe，用于dna水平特定位点特定碱基的突变。
29、其中，胞嘧啶碱基编辑器cbe可介导c·g--t·a突变。腺嘌呤碱基编辑器abe可介导a·t--g·c突变。
30、第五方面，本发明提供一种多核苷酸，编码所述碱基编辑器中的融合蛋白。
31、第六方面，本发明还提供一种载体，含有所述的多核苷酸。
32、第七方面，本发明还提供一种宿主细胞，含所述碱基编辑器，或含有所述载体。
33、第八方面，本发明第还提供一种试剂盒，包含用于构建所述碱基编辑器的试剂。
34、本发明通过将胞苷脱氨酶或其突变体融合于nogeiscb为代表的突变型核酸酶的c末端，得到的新融合蛋白能对位于前间隔序列不同位置的胞嘧啶实现有效的c-t碱基突变，通过将脱氧腺苷脱氨酶或其突变体融合于ogeiscb为代表的突变型核酸酶的c末端，得到的新融合蛋白能对位于前间隔序列不同位置的腺嘌呤和/或胞嘧啶实现有效的a-g和/或c-t碱基突变。通过本发明的方法获得的不同融合蛋白，其可突变范围各有差异。
35、与现有技术相比，本发明的碱基编辑器体积小，活性高，且活性窗口多样化，可实现更广范围、更精细且安全性更高的c-t单碱基替换和a-g单碱基替换，能有效拓宽单碱基编辑工具的应用，具有很高的应用价值。
36、与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果主要体现在以下方面：
37、1、本发明对核酸酶ogeiscb的向导rna(grna)进行改造，降低了grna的长度并提升了ogeiscb在哺乳动物细胞中的dna编辑活性。
38、2、本发明首次获得了nogeiscb为基础的微型化碱基编辑器abe和cbe(ogeabes,ogecbes)。通过本发明的方法获得的各类融合蛋白，其可突变范围各有差异。本发明的碱基编辑器体积更小，且活性窗口多样化，可实现更广范围、更精细且安全性更高的c-t单碱基替换和a-g单碱基替换，能有效拓宽单碱基编辑工具的应用。此外，与已知报道相比，本发明中的微型化be(ogebes)具有更高的碱基编辑活性。
1.一种改造的ogeiscb的grna，其特征在于，改造的ogeiscb的grna选自以下中的一种：
2.一种碱基编辑器，其特征在于，为将胞苷脱氨酶或脱氧腺苷脱氨酶置于突变型核酸酶nogeiscb的c-末端融合位点形成的融合蛋白ogebes；
3.根据权利要求2所述的一种碱基编辑器，其特征在于，所述脱氧腺苷脱氨酶选择为tada-8e或tada-8e突变体，所述碱基编辑器为在nogeiscb的c-末端融合一个或多个tada-8e或tada-8e突变体后形成的融合蛋白；
4.根据权利要求2所述的一种碱基编辑器，其特征在于，所述脱氧腺苷脱氨酶选择为tada*或tada*突变体，所述碱基编辑器选择以下中的一种：
5.根据权利要求2所述的一种碱基编辑器，其特征在于，所述碱基编辑器选择以下中的一种：
6.权利要求2-5中任一项所述碱基编辑器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.权利要求2-5中任一项所述碱基编辑器的应用，其特征在于，所述碱基编辑器，作为胞嘧啶碱基编辑器cbe、腺嘌呤碱基编辑器abe，用于dna水平特定位点特定碱基的突变；其中，胞嘧啶碱基编辑器cbe介导c·g--t·a突变，腺嘌呤碱基编辑器abe介导a·t--g·c突变。
8.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求2-5中任一项所述碱基编辑器中的融合蛋白。
9.一种载体，其特征在于，含有权利要求8所述的多核苷酸。
10.一种宿主细胞，其特征在于，含权利要求2-5中任一项所述碱基编辑器，或含有权利要求9所述载体。
