本发明涉及病毒领域和肿瘤治疗领域。具体而言，本发明涉及包含位于结构蛋白的特定氨基酸位点的柯萨奇病毒b组1型(cvb1)，以此类cvb1为病毒骨架进一步包含外源核酸的重组病毒，以及它们用于治疗肿瘤的用途。本发明还涉及使用此类cvb1或重组病毒用于治疗肿瘤的方法。
背景技术：
1、利用溶瘤病毒对肿瘤的治疗方法目前被认为比较有前景的肿瘤治疗手段。溶瘤病毒能够在肿瘤细胞当中自我复制，从而杀死、溶解肿瘤细胞，或者使肿瘤细胞生长停滞。然而使用溶瘤病毒可能会带来非特异性病毒感染健康细胞，从而导致非癌细胞和组织死亡的风险。因此，在选择性杀伤癌细胞的同时，维持正常、非癌细胞的健康和活力，以减少甚至消除不期望的脱靶效应，对于发展溶瘤病毒疗法是至关重要的。
2、目前已有报道柯萨奇病毒b组1型(coxsackivirus b1，cvb1)的溶瘤活性，然而柯萨奇病毒b组1型在感染人体后可能导致新生儿、婴幼儿以及免疫缺陷的成人出现病毒性心肌炎、胰腺炎、肝炎、无菌性脑膜炎以及胰岛素依赖型糖尿病等慢性自身免疫性疾病。
3、因此，获得兼具肿瘤杀伤活性和更高的肿瘤特异性以提高安全性的病毒仍然是有必要的。
技术实现思路
1、发明人通过分析决定cvb1病毒的溶瘤活性和毒力的关键位点信息，提供了一类包含位于结构蛋白的特定氨基酸位点的cvb1病毒，其在具备广泛有效的溶瘤活性的同时，具有明显降低的对正常非癌细胞的毒力，由此提供了以下发明。
2、包含位于结构蛋白的特定氨基酸位点的cvb1
3、在第一方面，本发明提供了分离的柯萨奇病毒b组1型(cvb1)，其中，所述cvb1的vp1蛋白第84位氨基酸为赖氨酸k，vp1蛋白第224位氨基酸为缬氨酸v，并且vp3蛋白第232位氨基酸为甘氨酸g。
4、在本文中，表述“cvb1的vp1蛋白”是指由所述cvb1基因组编码的vp1蛋白，表述“cvb1的vp1基因”是指病毒基因组中编码vp1蛋白的核酸序列。类似地，表述“cvb1的vp3蛋白”是指由所述cvb1基因组编码的vp3蛋白，表述“cvb1的vp3基因”是指病毒基因组中编码vp3蛋白的核酸序列。
5、在某些实施方案中，所述cvb1的vp1基因中对应vp1蛋白第84位氨基酸的密码子为编码赖氨酸k的密码子，对应vp1蛋白第224位氨基酸的密码子为编码缬氨酸v的密码子，并且所述cvb1的vp3基因中对应vp3蛋白第232位氨基酸的密码子为编码甘氨酸g的密码子。在某些实施方案中，所述cvb1的vp1基因位于病毒基因组2453--3286bp(所述位置参考seq idno:22所示的基因组序列)。在某些实施方案中，所述cvb1的vp3基因位于病毒基因组1739--2452bp(所述位置参考seq id no:22所示的基因组序列)。
6、在某些实施方案中，所述cvb1的vp1蛋白具有如seq id no:39所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cvb1的vp3蛋白具有如seq idno:41所示的氨基酸序列。
7、在某些实施方案中，所述cvb1的vp1基因具有如seq id no:40所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cvb1的vp3基因具有如seq idno:42所示的核苷酸序列。
8、在某些实施方案中，本发明所提供的cvb1可以是天然具备上述vp1/vp3蛋白特征的野生型毒株，例如从临床分离获得。
9、在某些实施方案中，本发明所提供的cvb1也可以是非天然存在的或工程化的cvb1毒株，其经人工改造(例如氨基酸置换)以具备上述vp1/vp3蛋白特征。
10、在某些实施方案中，所述cvb1的基因组序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如seq id no:22所示的核苷酸序列。
11、在某些示例性实施方案中，所述cvb1的基因组序列如seq id no:22所示。
12、在某些示例性实施方案中，所述cvb1的基因组序列与seq id no:22所示的序列相比差异仅在于，对应非结构蛋白3d第362位赖氨酸(k)的密码子被置换为编码谷氨酸(e)的密码子。在某些实施方案中，编码所述非结构蛋白3d的3d基因位于病毒基因组5903-7288bp(所述位置参考seq id no:22所示的基因组序列)。
13、在某些实施方案中，所述cvb1的cdna序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如seq id no:1所示的核苷酸序列。
14、在某些示例性实施方案中，所述cvb1的cdna序列如seq id no:1所示。
15、在某些示例性实施方案中，所述cvb1的cdna序列与seq id no:1所示的序列相比差异仅在于，对应非结构蛋白3d第362位赖氨酸(k)的密码子被置换为编码谷氨酸(e)的密码子。
16、在某些实施方案中，本发明所提供的上述cvb1可以作为病毒骨架来携带外源核酸以形成重组病毒。因此，在某些实施方案中，所述cvb1为重组病毒，并且包含(例如在其基因组中包含)外源核酸。为便于区分，在本文中，不包含外源核酸的cvb1也可称为cvb1病毒骨架，包含外源核酸的cvb1也可称为cvb1重组病毒或经修饰病毒。
17、本文所述的cvb1重组病毒可以通过反向遗传学技术获得，所述反向遗传学技术是本领域已知的，例如可参见yang l s，li s x，liu y j，et al.virus res，2015,210:165-168；hou w h,yang l s，li s x，et al.virus res，2015,205:41-44；其全部通过引用并入本文。在此类实施方案中，通常对原有cvb1毒株的cdna进行修饰(例如，外源核酸的插入)从而获得cvb1重组病毒。
18、在某些实施方案中，所述外源核酸选自编码细胞因子的核酸序列、编码抗肿瘤蛋白或多肽的核酸序列、微小rna的靶序列、或其任意组合。
19、在某些实施方案中，所述外源核酸包含编码细胞因子和/或编码抗肿瘤蛋白或多肽的核酸序列。
20、在某些实施方案中，所述细胞因子为具有抗肿瘤活性的细胞因子，例如白介素(例如il-2、il-12、il-15)、干扰素(例如ifn-α、ifn-β、ifn-γ)、肿瘤坏死因子(例如tnf-α)或集落刺激因子(例如gm-csf)。
21、在某些实施方案中，所述细胞因子为gm-csf(例如人gm-csf)。在某些示例性实施方案中，所述编码hgm-csf的核酸序列如seq id no:13所示。
22、在某些实施方案中，所述抗肿瘤蛋白或多肽为免疫检查点抑制剂(例如，pd-l1抗体、pd-1抗体、ctla-4抗体)。本文所用的术语“抗体”是指能够特异性结合靶抗原的源自免疫球蛋白的分子，所述源自免疫球蛋白的分子通过位于其可变区中的抗原结合位点来结合所述靶抗原。当提及术语“抗体”时，除非上下文明确指出，其不仅包括完整抗体也包括能够特异性结合靶抗原的抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体优选为抗原结合片段，例如scfv、fab、fab’、(fab’)2、fv、二硫键连接的fv或单域抗体(sdab)。
23、在某些实施方案中，所述抗肿瘤蛋白或多肽为抗pd-1或pd-l1的scfv(例如抗人pd-1或pd-l1的scfv)。在某些示例性实施方案中，所述编码抗人pd-1或pd-l1的scfv的核酸序列如seq id no:14所示。
24、在某些实施方案中，所述编码细胞因子和/或抗肿瘤蛋白或多肽的核酸序列的插入位点位于所述病毒基因组的5’utr与vp4基因之间，或者位于vp1基因与2a基因之间。
25、在某些实施方案中，所述外源核酸包含微小rna的靶序列。
26、在某些实施方案中，所述微小rna为肿瘤抑制性微小rna。
27、之前已报道，某些微小rna在肿瘤细胞中的表达量显著低于正常细胞和/或具有明显的组织特异性，这些微小rna可以被称为肿瘤抑制性微小rna。包含肿瘤抑制性微小rna的靶序列的重组病毒在非癌/正常细胞中的复制相比于癌细胞中的复制减少或减弱。
28、因此在某些情况下，将这类微小rna的靶序列插入本发明所提供的包含特定结构蛋白的cvb1的基因组以形成重组病毒是有利的，因为在正常细胞或组织内高表达的这类微小rna可以通过对应的靶序列减少甚至阻断重组cvb1病毒在该正常细胞或组织内的复制，从而减轻甚至避免重组病毒对非肿瘤细胞的毒副作用。这类微小rna是本领域已知，关于这类微小rna的详细教导可参见例如，kennedy,edward m et al.“design of aninterferon-resistant oncolytic hsv-1incorporating redundant safety modalitiesfor improved tolerability.”molecular therapy oncolytics vol.18 476-490.8aug.2020，其全部通过引用并入本文。
29、在某些实施方案中，所述微小rna的实例包括但不限于，心肌组织中特异性表达mir-1-3p、mir-126-3p等；胰腺组织中特异性表达的mir-216a-5p、mir-217-5p等；脊髓组织中特异性表达的mir-204-5p、mir-219a-5p等；肝组织特异性表达的mir-122，mir-192，mir-483等；胰腺组织特异性表达的mir216a/b、mir-217和mir-375；心脏特异性表达的mir-1，mir-133a/b，mir-208等；肾组织特异性表达的mir-192，mir-196a/b，mir-204，mir-215等；肌肉组织特异性表达的mir-133a/b，mir-206等；脊髓组织特异性表达的mir-204、mir219a等；脑组织特异性表达的mir-124a，mir-125a/b，mir-128a/b，mir-138等；以及在肝肿瘤组织内低表达的mir-34，mir-122a，mir-26a；在胰腺肿瘤组织内低表达的mir-107，mir-96和mir-196；在肾肿瘤组织内低表达的mir-34；在膀胱肿瘤组织内低表达的mir-143，mir-133a/b；在肺肿瘤组织内低表达的mir-let-7，mir-29；等等。
30、在某些实施方案中，所述微小rna选自例如mir-1-3p、mir-126-3p、mir-204-5p、mir-217-5p、mir-219a-5、或其任意组合。
31、在某些实施方案中，所述微小rna包含mir-1-3p和/或mir-126-3p。在某些示例性实施方案中，所述mir-1-3p的靶序列如seq id no:4所示。在某些示例性实施方案中，所述mir-126-3p的靶序列如seq id no:5所示。在某些情况下，mir-1-3p和/或mir-126-3p的靶序列的插入是有利的。这是由于mir-1-3p和mir-126-3p在心肌组织中特异性表达，因此通过将mir-1-3p和/或mir-126-3p的靶序列插入所述经修饰的cvb1中的方式可以改变该溶瘤病毒的组织嗜性，以减小或避免对正常心肌组织的杀伤。
32、在某些实施方案中，所述微小rna包含mir-216a-5p和/或mir-217-5p。在某些示例性实施方案中，所述mir-216a-5p的靶序列如seq id no:7所示。在某些示例性实施方案中，所述mir-217-5p的靶序列如seq id no:8所示。在某些情况下，mir-216a-5p和/或mir-217-5p的靶序列的插入是有利的。这是由于mir-216a-5p和mir-217-5p在胰腺组织中特异性表达，因此通过将mir-216a-5p和/或mir-217-5p的靶序列插入所述经修饰的cvb1中的方式可以改变该溶瘤病毒的组织嗜性，以减小或避免对正常胰腺组织的杀伤。
33、在某些实施方案中，所述微小rna包含mir-204-5p和/或mir-219a-5p。在某些示例性实施方案中，所述mir-204-5p的靶序列如seq id no:6所示。在某些示例性实施方案中，所述mir-219a-5p的靶序列如seq id no:9所示。在某些情况下，mir-204-5p和/或mir-219a-5p的靶序列的插入是有利的。这是由于mir-204-5p和mir-219a-5p在脊髓组织中特异性表达，因此通过将mir-204-5p和/或mir-219a-5p的靶序列插入所述经修饰的cvb1中的方式可以改变该溶瘤病毒的组织嗜性，以减小或避免对正常脊髓组织的杀伤。
34、在某些实施方案中，所述重组病毒包含一个或多个(例如1个，2个，3个或4个)微小rna的靶序列。在某些实施方案中，所述靶序列可以包括一个或多个(例如1个，2个，3个或4个)拷贝。
35、在某些实施方案中，所述微小rna的靶序列的插入位点在所述病毒基因组的5’非翻译区(5’utr)和/或3’非翻译区(3’utr)。例如，5’非翻译区的插入位点为737-738bp之间。例如，3’非翻译区的插入位点为7296-7297bp。在某些实施方案中，所述病毒基因组的5’utr和3’utr均插入有所述微小rna的靶序列。
36、在某些实施方案中，所述重组病毒的基因组序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如seq id no:25-29任一项所示的核苷酸序列。在某些示例性实施方案中，所述重组病毒的基因组序列如seqid no:25-29任一项所示。在某些示例性实施方案中，所述重组病毒的基因组序列与seq idno:25-29任一项所示的序列相比差异仅在于，对应非结构蛋白3d第362位赖氨酸(k)的密码子被置换为编码谷氨酸(e)的密码子。
37、在某些实施方案中，所述重组病毒的cdna序列与选自下列的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如seq id no:17-21任一项所示的核苷酸序列。在某些示例性实施方案中，所述重组病毒的cdna序列如seq id no:17-21任一项所示。在某些示例性实施方案中，所述重组病毒的cdna序列与seq id no:17-21任一项所示的序列相比差异仅在于，对应非结构蛋白3d第362位赖氨酸(k)的密码子被置换为编码谷氨酸(e)的密码子。
38、在某些实施方案中，上述任意实施方案中所述的cvb1可以经预处理以减少或消除受试者对该病毒的免疫反应，其中所述预处理可以包括：将所述cvb1装载在细胞(例如：人间充质干细胞、淋巴细胞等)、脂质体或胶束中，和/或使用蛋白酶(例如，糜蛋白酶或胰蛋白酶)去除病毒的衣壳蛋白以减小宿主对病毒的体液和/或细胞免疫。
39、在第二方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含选自下列的序列：
40、(1)第一方面所述的分离的cvb1的基因组序列或cdna序列；和
41、(2)所述基因组序列或cdna序列的互补序列。
42、在某些实施方案中，所述分离的核酸分子由所述cvb1的基因组序列或cdna序列，或所述基因组序列或cdna序列的互补序列组成。在某些实施方案中，所述核酸分子具有所述cvb1的基因组序列。在某些示例性实施方案中，所述核酸分子具有如seq id no:22，25-29任一项所示的核苷酸序列。在某些示例性实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列与seqid no:22，25-29任一项所示的序列相比差异仅在于，对应非结构蛋白3d第362位赖氨酸(k)的密码子被置换为编码谷氨酸(e)的密码子。
43、在某些实施方案中，所述分离的核酸分子为包含所述cvb1的基因组序列或cdna序列，或所述基因组序列或cdna序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。在某些实施方案中，所述核酸分子为包含所述cvb1的cdna序列，或所述cdna序列的互补序列的载体(例如，克隆载体或表达载体)。在某些示例性实施方案中，所述核酸分子为包含seqidno:1，17-21任一项所示的核苷酸序列的载体。在某些示例性实施方案中，所述核酸分子为包含下述核苷酸序列的载体：所述核苷酸序列与seq id no:1，17-21任一项所示的序列相比差异仅在于，对应非结构蛋白3d第362位赖氨酸(k)的密码子被置换为编码谷氨酸(e)的密码子。
44、病毒的制备
45、本发明所提供的cvb1(包括cvb1病毒骨架以及cvb1重组病毒)可以通过反向遗传学技术获得。基于感染性克隆的反向遗传学技术(即，病毒拯救)是广泛应用于rna病毒领域的分子生物学技术。该技术是在已知病毒基因组序列的前提下，利用载体构建病毒基因组全长cdna分子克隆，之后转染细胞得到活病毒。由于肠道病毒是正链rna病毒，其rna能够直接翻译病毒蛋白，也即肠道病毒的基因组rna直接具有感染能力，因此只要保证完整的全长rna的转染即可拯救出病毒。
46、因此，在另一方面，本发明还提供了制备第一方面所述的cvb1的方法，其包括：(1)提供包含所述cvb1的cdna序列的载体(例如质粒)以获得感染性克隆；(2)将所述感染性克隆引入(例如转染)宿主细胞；(3)从所述宿主细胞的培养物和/或裂解物中获得病毒(即，拯救病毒)。
47、在某些实施方案中，步骤(2)包括将所述感染性克隆和辅助质粒共同引入(例如转染)宿主细胞。
48、在某些实施方案中，所述感染性克隆包含t7启动子。在某些实施方案中，所述感染性克隆的骨架载体为psva质粒。
49、在某些实施方案中，所述辅助质粒表达t7 rna聚合酶。在某些实施方案中，所述辅助质粒为par3126质粒。
50、在某些实施方案中，所述宿主细胞为真核细胞。
51、药物组合物
52、在第三方面，本发明提供了药物组合物，其包含第一方面所述的分离的cvb1或第二方面所述的核酸分子，以及药学上可接受的载体或赋形剂(例如稳定剂)。
53、在某些实施方案中，所述药物组合物包含有效量的第一方面所述的分离的cvb1。在某些实施方案中，可以组合使用第一方面所述的分离的cvb1。因此，所述药物组合物可以包括第一方面所述的分离的cvb1中的一种或数种。
54、在某些实施方案中，所述药物组合物包含一种或多种第一方面中提供的cvb1病毒骨架。在某些实施方案中，所述药物组合物包含一种或多种第一方面中提供的cvb1重组病毒。在某些实施方案中，所述药物组合物包含一种或多种第一方面中提供的cvb1病毒骨架和cvb1重组病毒的任意组合。
55、在某些实施方案中，所述药物组合物包含有效量的第二方面所述的核酸分子。在某些实施方案中，所述药物组合物包含第一方面所述的分离的cvb1的基因组序列。在某些实施方案中，所述药物组合物包含包括第一方面所述的分离的cvb1的cdna序列的载体。
56、本发明的核酸分子可以通过本领域已知的任何方式进行递送，例如，直接注射裸露的核酸分子(例如，裸rna)，或利用非病毒递送系统(non-viral delivery system)。所述非病毒递送系统可通过本领域熟知的各种材料制备获得，其中所述材料包括但不限于详细描述于“yin h,et al.nat rev genet.2014aug；15(8):541-55.”以及“riley mk,vermerris w.nanomaterials(basel).2017apr 28；7(5).pii:e94.”中的各种材料，其全部通过引用并入本文，例如脂质体、无机纳米粒子(如金纳米颗粒)、多聚物(如peg)等等。
57、因此，所述药物组合物可以包含第二方面所述的核酸分子以及递送系统。
58、在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。在某些实施方案中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
59、在本发明中，所述另外的溶瘤病毒包括但不限于疱疹病毒、腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒或其任意组合。所述化学治疗剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环类(如表柔比星或多柔比星)、依托泊苷、铂类化合物(如卡铂或顺铂)、紫杉烷类(如紫杉醇或紫杉特尔)或其任意组合。所述免疫治疗剂包括但不限于免疫检查点抑制剂(如pd-l1/pd-1抑制剂或ctla-4抑制剂)、肿瘤特异性靶向抗体(如利妥昔单抗或赫赛汀)或其任意组合。
60、在某些实施方案中，在所述药物组合物中，第一方面所述的分离的cvb1或第二方面所述的核酸分子与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，第一方面所述的分离的cvb1或第二方面所述的核酸分子与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
61、第一方面所述的分离的cvb1、第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。在某些实施方案中，优选的剂型是注射剂，注射液或冻干粉剂。
62、第一方面所述的分离的cvb1、第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的药物组合物可以通过各种合适的方式施用。在某些情况下，它们的施用方式取决于肿瘤的位置和类型。例如，对于容易接近的实体肿瘤，任选地通过直接向肿瘤注射(例如，瘤内注射)来施用该病毒或核酸分子；对于造血系统的肿瘤，可以通过静脉内或其他血管内途径施用该病毒或核酸分子；对于体内不容易接近的肿瘤(例如转移瘤)，可以系统地施用该病毒或核酸分子以使其遍布全身并由此到达肿瘤(例如，静脉内或肌肉内注射)。任选地，可以经皮下、腹膜内、鞘内(例如对于脑部肿瘤)、局部(例如对于黑素瘤)、口服(例如对于口腔或食道癌)、经鼻或通过吸入喷雾(例如对于肺癌)等途径施用本发明的病毒或核酸分子。在某些实施方案中，可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用第一方面所述的分离的cvb1、第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的药物组合物。
63、在某些实施方案中，所述药物组合物包含单位剂量的第一方面所述的cvb1，例如包含至少1×102pfu、至少1×103pfu、至少1×104pfu、1×105pfu、1×106pfu、至少1×107pfu、至少1×108pfu、至少1×109pfu、至少1×1010pfu、至少1×1011pfu、至少1×1012pfu、至少1×1013pfu、至少1×1014pfu或至少1×1016pfu的cvb1。在某些实施方案中，所述药物包含1×102pfu～1×1017pfu的cvb1。
64、在某些实施方案中，所述药物组合物含有单位剂量的第二方面所述的核酸分子，例如含有3×1010～3×1014病毒基因组拷贝数(virus genome copies)的所述核酸分子。
65、抗肿瘤应用
66、在另一方面，本发明提供了用于在受试者(例如人)中治疗肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的第一方面所述的cvb1、第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的药物组合物。本发明还提供了第一方面所述的cvb1、第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的药物组合物用于在受试者中治疗肿瘤的用途，或者用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物的用途。
67、在某些实施方案中，所述肿瘤为实体瘤或血液肿瘤。
68、在某些实施方案中，所述肿瘤为实体瘤。
69、在某些实施方案中，所述肿瘤选自结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、成骨肉瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、舌癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、咽鳞癌、颌下腺鳞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌和膀胱癌。
70、在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
71、在某些实施方案中，可以组合使用第一方面所述的分离的cvb1。因此，可以施用第一方面所述的分离的cvb1中的一种或数种。
72、在某些实施方案中，可以组合使用第二方面所述的分离的核酸分子。因此，可以施用第二方面所述的分离的核酸分子中的一种或数种。
73、在某些实施方案中，第一方面所述的cvb1、第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的药物组合物可以与具有抗肿瘤活性的另外的药学活性剂联合使用。
74、在某些实施方案中，第一方面所述的cvb1、第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的药物组合物可以与第二治疗剂(如抗肿瘤剂)或治疗术(例如手术、化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗、激素治疗、基因治疗或姑息治疗)组合施用。所述第二治疗剂或治疗术可以在施用本发明的上述试剂之前、同时或之后施用。
75、在某些实施方案中，所述第二治疗剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
76、在某些实施方案中，可以以1～1×1015pfu/kg受试者体重的任何量施用第一方面所述的cvb1，例如以至少1×103pfu/kg、至少1×104pfu/kg、1×105pfu/kg、1×106pfu/kg、至少1×107pfu/kg、至少1×108pfu/kg、至少1×109pfu/kg、至少1×1010pfu/kg、至少1×1011pfu/kg或至少1×1012pfu/kg受试者体重的量施用cvb1。在某些实施方案中，可以以3×1010～3×1014病毒基因组拷贝数(virus genome copies)/kg受试者体重的任何量施用第二方面所述的核酸分子。在某些实施方案中，可以以每日3次、每日2次、每日1次、每两日1次或每周1次的方式施用cvb1，或如本文所述的核酸分子，任选地酌情每周或每月重复如上所述的给药方案。
77、术语定义
78、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、细胞培养、生物化学、细胞生物学、核酸化学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
79、如本文中所使用的，术语“柯萨奇病毒b组1型(coxsackivirus b1，cvb1)”是指，小核糖核酸病毒科(picomaviridae)、肠道病毒属(enterovirus)、柯萨奇病毒(coxsackivirus)b组中的一种，其基因组为单股正链rna，由5’非编码区(5’utr)、一个开放阅读框(orf)、3’非编码区(3’utr)和多聚腺苷酸尾巴组成；其orf编码一个前体多聚蛋白，经过自身蛋白酶水解切割，可产生结构蛋白vp1～vp4和非结构蛋白2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d；为了更加清楚地描述本发明，cvb1基因组中上述各蛋白所对应的核酸序列分别称为vp1基因、vp2基因、vp3基因、vp4基因、2a基因、2b基因、2c基因、3a基因、3b基因、3c基因和3d基因。cvb1可以作为病毒骨架进一步包含外源核酸以形成重组病毒(或经修饰病毒)。因此，在本发明中，表述“柯萨奇病毒b组1型(coxsackivirus b1，cvb1)”即包括cvb1病毒骨架自身也包括重组病毒(或经修饰病毒)。
80、如本文中所使用的，术语“溶瘤病毒”是指，能够感染肿瘤细胞，在肿瘤细胞中复制，引起肿瘤细胞死亡、裂解或阻止肿瘤细胞生长的病毒。优选地，该病毒对非肿瘤细胞具有很小的毒性效应。
81、如本文中所使用的，术语“肿瘤特异性”是指，选择性地在肿瘤细胞内展现出生物功能或活性。例如，在本发明中，当术语“肿瘤特异性”用于描述病毒的杀伤选择性时，意指该病毒能够选择性杀伤肿瘤细胞而不杀伤或基本上不杀伤非肿瘤细胞，或者，该病毒对肿瘤细胞的杀伤比对非肿瘤细胞的杀伤更为有效。
82、如本文中所使用的，术语“溶瘤活性”主要包括肿瘤杀伤活性。当描述病毒的溶瘤活性时，通常可以通过其病毒感染肿瘤细胞的能力、在肿瘤细胞内复制的能力和/或杀伤肿瘤细胞的能力等指标衡量该病毒的溶瘤活性。病毒的溶瘤活性可以采用本领域已知的任何方法进行测定。例如，病毒感染肿瘤细胞的能力可以通过测量感染给定百分率的肿瘤细胞(例如50％细胞)所需要的病毒剂量进行评价；在肿瘤细胞内复制的能力可以通过测量病毒在肿瘤细胞内的生长情况进行评价；杀伤肿瘤细胞的能力可以通过观察致细胞病变效应(cpe)或测量肿瘤细胞活性进行评价。
83、如本文中所使用的，术语“毒性”是指，cvb1在攻毒小鼠后表现出的致病能力，主要通过监测小鼠生存率、体重和健康分数进行评价。
84、如本文中所使用的，表述“cvb1的cdna序列”意指，该病毒基因组rna序列的dna表示形式，其与所述rna序列相比差异仅在于所述rna序列中的核糖核苷酸被对应的脱氧核糖核苷酸替代，例如尿嘧啶核糖核苷酸(ump)由胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dtmp)替代。
85、如本文中所使用的，术语“外源核酸”是指，人工引入的核苷酸序列，其相对于原始序列而言是外来的。外源核酸包括但不限于，未在所述病毒基因组中发现的任何基因或核苷酸序列。然而，在本发明中，特别优选地，所述外源核酸由至多1500个，例如至多1200个，至多1000个核苷酸组成。在某些情况下，优选地，外源核酸编码具有抗肿瘤杀伤活性的蛋白或多肽，例如细胞因子、或抗肿瘤蛋白或多肽；或者，外源核酸包含微小rna(microrna，mirna)的靶序列。在本发明中，所述微小rna优选为那些在肿瘤细胞中的表达量显著低于正常细胞和/或具有明显的组织特异性的微小rna(即，肿瘤抑制性微小rna)，其实例包括但不限于，心肌组织中特异性表达mir-1-3p、mir-126-3p等；胰腺组织中特异性表达的mir-216a-5p、mir-217-5p等；脊髓组织中特异性表达的mir-204-5p、mir-219a-5p等；肝组织特异性表达的mir-122，mir-192，mir-483等；胰腺组织特异性表达的mir216a/b、mir-217和mir-375；心脏特异性表达的mir-1，mir-133a/b，mir-208等；肾组织特异性表达的mir-192，mir-196a/b，mir-204，mir-215等；肌肉组织特异性表达的mir-133a/b，mir-206等；脊髓组织特异性表达的mir-204、mir219a等；脑组织特异性表达的mir-124a，mir-125a/b，mir-128a/b，mir-138等；以及在肝肿瘤组织内低表达的mir-34，mir-122a，mir-26a；在胰腺肿瘤组织内低表达的mir-107，mir-96和mir-196；在肾肿瘤组织内低表达的mir-34；在膀胱肿瘤组织内低表达的mir-143，mir-133a/b；在肺肿瘤组织内低表达的mir-let-7，mir-29，等等(参见，例如，ruiz a j and russell s j.micrornas and oncolytic viruses.[j].curropin virol,2015,13:40–48；kennedy,edward m et al.“design of an interferon-resistant oncolytic hsv-1incorporating redundant safety modalities forimproved tolerability.”molecular therapy oncolytics vol.18 476-490.8aug.2020；其全部通过引用并入本文)。
86、在本发明中，当重组cvb1包含上述微小rna的靶序列时，其在该microrna高表达或特异性表达的细胞/组织中，受到该microrna的调控，从而可使该溶瘤病毒的复制减弱、甚至丧失杀伤活性，而在该microrna低表达或不表达的肿瘤细胞/组织中则正常复制、正常杀伤肿瘤细胞。
87、如本文中所使用的，术语“细胞因子”具有本领域技术人员公知的含义。然而，在本发明中，当使用本发明的溶瘤病毒来治疗肿瘤时，特别优选地，所述细胞因子为能够用于肿瘤治疗的细胞因子。“细胞因子”的实例包括但不限于，白介素(例如il-2、il-12和il-15)、干扰素(例如ifn-α、ifn-β、ifn-γ)、肿瘤坏死因子(例如tnf-α)、集落刺激因子(例如gm-csf)，及其任何组合(参见例如，ardolino m,hsu j,raulet d h.cytokine treatment incancer immunotherapy[j].oncotarget,2015,6(23):19346-19347)。
88、如本文中所使用的，术语“抗肿瘤蛋白或多肽”是指，具有治疗肿瘤活性的蛋白或多肽，其包括但不限于：(1)对细胞具有毒性、可抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的蛋白或多肽，其实例包括但不限于胸苷激酶tk(tk/gcv)、trail和fasl(参见例如，candolfi m,kingg d,muhammad a g,et al.evaluation of proapototic transgenes to use incombination with flt3l in an immune-stimulatory gene therapy approach forglioblastoma multiforme(gbm)[j].faseb j,2008,22:1077.13)；(2)具有免疫治疗作用的蛋白或多肽，其实例包括但不限于抗细胞毒t淋巴细胞相关抗原4(anti-ctla-4)、抗程序性死亡受体1(anti-pd-1)的单链抗体(scfv)或纳米抗体和抗程序性死亡配体1(anti-pdl-1)的单链抗体(scfv)或纳米抗体(参见例如，nolan e,savas p,policheni a n,etal.combined immune checkpoint blockade as a therapeutic strategy for brca1-mutated breast cancer[j].science trans med,2017,9:eaal4922；其全部通过引用并入本文)；(3)抑制肿瘤血管生成的蛋白或多肽，其实例包括但不限于抗血管内皮生长因子(anti-vegf)的单链抗体(scfv)、vegf来源多肽(例如d(lpr)、ksvrgkgkgqkrkrkksryk等)和atn-161(参见例如，rosca e v，koskimaki j e，rivera c g，et al.anti-angiogenicpeptides for cancer therapeutics[j].curr pharm biotechnol，2011,12(8):1101–1116；其全部通过引用并入本文)。
89、如本文中所使用的，术语“scfv”是指，包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的单个多肽链，其中所述vl和vh通过接头(linker)相连。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-接头-vh-cooh或nh2-vh-接头-vl-cooh。
90、如本文中所使用的，术语“fab片段”意指由vl、vh、cl和ch1结构域组成的抗体片段；术语“f(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的抗体片段；术语“fab’片段”意指还原连接f(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的fd片段(由vh和ch1结构域组成)组成；术语“fv”意指由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的抗体片段；术语“单域抗体(single-domain antibody,sdab)”是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。
91、如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
92、如本文中所使用的，表述“包含cvb1的基因组序列的核酸分子”或“核酸分子包含cvb1的基因组序列”具有本领域技术人员通常理解的含义，即当所述核酸分子为dna时，所述核酸分子包含cvb1(例如病毒骨架或重组病毒)的基因组序列的dna表示形式；当所述核酸分子为rna时，所述核酸分子包含cvb1(例如病毒骨架或重组病毒)的基因组序列。
93、如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指，在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington's pharmaceutical sciences.edited by gennaro ar,19thed.pennsylvania:mack publishing company,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，稀释剂，佐剂，防腐剂，稳定剂等。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性(例如溶瘤活性)，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，spga，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。
94、如本文中所使用的，术语“治疗”是指，治疗或治愈疾病(例如肿瘤)，延缓疾病(例如肿瘤)症状的发作，和/或延缓疾病(例如肿瘤)的发展。
95、如本文中所使用的，术语“有效量”是指，可以有效实现预期目的的量。例如，治疗有效量可以是有效地或足以治疗或治愈疾病(例如肿瘤)，延缓疾病(例如肿瘤)症状的发作和/或延缓疾病(例如肿瘤)发展的量。这样的有效量可以由本领域技术人员或医生容易地确定，并且可以与预期目的(例如治疗)、受试者的一般健康状况、年龄、性别、体重、待治疗的疾病的严重程度、并发症、施用方式等相关。这样的有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
96、如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有肿瘤，或者，具有患有肿瘤的风险。
97、如本文中使用的，术语“癌症”“肿瘤”可互换使用，其是指以体内异常细胞的不受控生长为特征的一大类疾病。不受管制的细胞分裂可能导致恶性肿瘤或侵入邻近组织的细胞的形成，并可能通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部位。癌症包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。癌症也包括血液学恶性肿瘤，例如淋巴瘤，白血病，骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤，以及脾癌和淋巴结肿瘤。
98、发明的有益效果
99、本发明提供了包含位于结构蛋白(例如vp1和/或vp3蛋白)的特定氨基酸位点的一类cvb1毒株，这类cvb1毒株具有高效广谱的肿瘤杀伤活性，同时具备明显降低的毒性以及显著提高的安全性。本发明提供的cvb1溶瘤毒株可单独用于肿瘤的治疗，亦可用作传统肿瘤治疗的辅助方法，或作为缺少其他治疗方法时的治疗手段，具有重要的临床价值。
100、下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
1.分离的柯萨奇病毒b组1型(cvb1)，其中，所述cvb1的vp1蛋白第84位氨基酸为赖氨酸(k)，vp1蛋白第224位氨基酸为缬氨酸(v)，并且vp3蛋白第232位氨基酸为甘氨酸(g)。
2.权利要求1所述的cvb1，其中，所述cvb1的vp1蛋白具有如seq id no:39所示的氨基酸序列，和/或，所述vp3蛋白具有如seq id no:41所示的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述的cvb1，其中，
4.权利要求1-3任一项所述的cvb1，其中，所述cvb1为重组病毒，并且包含外源核酸；
5.权利要求4所述的cvb1，其中，所述外源核酸包含编码细胞因子和/或编码抗肿瘤蛋白或多肽的核酸序列；
6.权利要求4或5所述的cvb1，其中，所述外源核酸包含微小rna的靶序列；
7.权利要求4-6任一项所述的cvb1，其中，
8.分离的核酸分子，其包含：
9.权利要求8所述的核酸分子，其中：
10.药物组合物，其包含权利要求1-7任一项所述的分离的cvb1、或权利要求8或9所述的分离的核酸分子，以及药学上可接受的载体或赋形剂；
11.权利要求1-7任一项所述的分离的cvb1、或权利要求8或9所述的分离的核酸分子、或权利要求10所述的药物组合物用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物的用途。
12.权利要求11所述的用途，其中，所述肿瘤选自实体瘤或血液肿瘤，例如结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、成骨肉瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、舌癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、咽鳞癌、颌下腺鳞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌和膀胱癌。
13.权利要求11或12所述的用途，其中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
14.权利要求11-13任一项所述的用途，其中，所述分离的cvb1、分离的核酸分子、或药物组合物与具有抗肿瘤活性的另外的药学活性剂联合使用；
