本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水及其制备方法和应用。
背景技术：
1、创伤、感染、肿瘤和退行性病变等导致的组织病缺损是影响人类健康的主要危害，目前病缺损组织的修复与重建仍然面临诸多挑战。快速发展的3d生物打印技术为工程化的组织和器官的构建提供了新的途径，使病缺损组织的个性化修复与重建成为可能。
2、3d生物打印是在快速成型技术发展的基础上，结合计算机辅助设计技术，细胞生物学和生物材料科学而形成的一种工程化组织和器官构建的技术。一般地，3d生物打印是将生物材料（生物墨水）和细胞一起作为打印原料，按照仿生形态、生物学功能及细胞外微环境等要求，用3d打印方式构建出具有复杂结构和生理功能的三维生物功能体。显然，在3d生物打印过程中，生物墨水材料发挥了重要的作用。理想的生物墨水材料不仅需要具有良好的可3d打印性、机械性能与适宜的力学强度，满足3d打印过程中对打印速率和分辨率的要求；还需要具有优良的可降解性和生物相容性，同时也应具有良好的生物活性，可以为体外细胞提供有利的生化环境，支持细胞生长和增殖，并能在微观尺度上控制细胞的排列分布方式以及调控细胞的种类。水凝胶具有优异的生物相容性及高含水量，常被应用于生物墨水的制备，如甲基丙烯酰化明胶（gelma）具有良好的机械性能和细胞反应特性，甲基丙烯酰化透明质酸（hama）拥有良好的生物相容性，由此两种材料构成的可3d打印生物墨水，可以通过光交联方式组成的机械强度优良的双网络水凝胶，用于多种组织器官的3d打印构建。同时，在3d生物打印构建组织器官的过程中，提高生物墨水的生物活性，实现组织或器官的快速形成一直是该领域一个重要的研究和发展方向。包括生长因子等多种生物活性物质被用于构建高生物活性的生物墨水，在工程化的组织或器官的构建中展示了明确的应用前景。
3、通过化学、生物、物理方法对从柑橘、柠檬、橙子、柚子的果皮、果肉中提取的柑橘果胶进行改性，可以获得分子量低于35千道尔顿（kda）、酯化度低于30％的改性柑橘果胶（modified citrus pectin，mcp），该多糖主链由α-1，4糖苷键连接半乳糖醛酸形成的同型半乳糖醛酸聚糖组成，侧链包括鼠李糖半乳糖醛酸聚糖和阿拉伯半乳糖醛酸聚糖，具有良好的溶解性。尤其是，mcp具有良好的生物活性，可以发挥免疫调节作用，可以激活t辅助细胞/诱导细胞、b细胞和自然吞噬（nk）细胞。特别是，mcp是前炎性因子半乳糖苷凝集素-3（galectin-3，gal-3）的天然拮抗剂。gal-3在组织损伤修复、慢性炎症（如骨关节炎、类风湿性关节炎）和组织纤维化（肝、肺等的纤维化）等过程中具有重要的调控作用，并参与了多种癌细胞的调节、肿瘤形成、发展和转移过程。mcp可以通过与 gal-3 的糖识别域结合，竞争性抑制 gal-3 的作用，具有抗炎、抗癌、吸附重金属、免疫调节、降血脂等生物活性；同时，mcp具有优良的生物相容性、安全无毒和成本低等特点，在生物医学领域被广泛关注，在癌症、组织纤维化、动脉粥样硬化、病缺损组织的再生修复等疾病的治疗中展示了良好的应用价值。中国专利zl.202010734420.8公开了一种胶原基改性柑橘果胶复合材料及其制备方法和应用，该材料在组织再生修复中具有明确的应用前景。另外，发明专利202210876660.0公开了mcp具有促进软骨细胞增殖、维持软骨细胞表型的活性，在组织工程软骨构建中具有良好的应用前景。
4、基于以上分析，结合mcp与透明质酸钠、明胶、壳聚糖、海藻酸钠等天然高分子的光敏改性衍生物具有良好化学相容性的特点，可以看出，将二者复合，可以用于构建可3d打印的新型生物墨水，通过mcp的复合，提高生物墨水的生物活性，用于组织、器官的生物3d打印构建。。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水及其制备方法和应用。通过将改性柑橘果胶与可3d打印的水凝胶类生物墨水材料复合，构建得到的新型生物墨水材料具有良好的可打印性和生物相容性，并具有较好的生物活性，可用于多种工程化组织或器官的3d打印构建。
2、本发明提供的一种含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水，主要包括以下组分：光敏基团甲基丙烯酰胺化改性的明胶、透明质酸钠、海藻酸钠、壳聚糖等高分子衍生物，光引发剂以及改性柑橘果胶。所述的一种含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水，是采用共混方法将改性柑橘果胶复合于上述一种或两种复合的光敏高分子水凝胶材料溶液中，其中改性柑橘果胶的终浓度在0.01-10mg/ml范围内可调，光敏基团甲基丙烯酰胺化改性的明胶、透明质酸钠、海藻酸钠、壳聚糖等的终浓度在5-200mg/ml范围内可调。
3、本发明提供的一种含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水，其主要特征是其可以通过挤出式3d打印机打印、并通过紫外和或可见光在光引发剂作用下迅速固化，构建出具有三维结构的细胞载体支架，或与细胞复合后共同打印构建出含细胞的、具有复杂结构和生理功能的三维生物功能体。
4、本发明提供的一种含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水，可以添加其他生物活性因子，如生长因子等为细胞的增殖、分化提供良好的生化环境。
5、本发明提供一种含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水的制备方法，包括以下步骤：（1），将光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰次膦酸锂（lap，lithium phenyl-2,4 ,6-trimethylbenzoylphosphinate）加入至磷酸盐（pbs，ph，7.4）缓冲溶液中，水浴加热使其溶解，制成lap溶液；（2）避光条件下，将甲基丙烯酰胺化改性的明胶、透明质酸钠、海藻酸钠、壳聚糖等高分子衍生物分别单独加入至lap溶液中，水浴加热至完全溶解，形成甲基丙烯酰胺化高分子凝胶前体溶液；（3）避光条件下，将mcp加入至上述溶液中，水浴加热至完全溶解，形成含改性柑橘果胶的高分子凝胶前体溶液，即含改性柑橘果胶的可3d打印复合生物墨水；（4）也可以在避光条件下，通过溶液混合，将上述光敏改性高分子材料组合制备双网络水凝胶前体溶液，最终得到含改性柑橘果胶的可3d打印复合生物墨水；（5）避光条件下，含改性柑橘果胶的可3d打印复合生物墨水可置于4℃冰箱中低温存储或用于3d打印。
6、本发明所述的一种含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水的用途，该水凝胶生物墨水材料主要用于3d生物打印。较佳地，所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水的3d生物打印，其接收平台温度为4℃，打印机整体温度与料筒温度为25℃-27℃，有利于生物墨水材料的完整打印；较佳地，所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水的3d生物打印，优选内径为300μm，长度为13mm的24g针头，挤出速度为1mm/s，打印效果更佳。较佳的，所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水的3d生物打印还包括，待所设计结构整体打印完成后，使用波长为405nm的蓝光照射约15s，进行水凝胶支架的光交联，也可以在所设计结构逐层打印后进行光照交联；所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水可以通过3d生物打印构建三维支架用于细胞接种和培养，也可以在无菌条件下与细胞混合，通过3d生物打印构建含细胞的三维功能结构。优先地，所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水可用于组织工程软骨构建和软骨损伤修复。
7、本发明所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水具有优异的生物相容性和细胞反应特性，可提供合适的细胞粘附位点；本发明所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水具有良好的可打印性能，并可以在蓝光照射下快速且不可逆固化，所打印制备的复合水凝胶支架形态可控、成型性好且稳定性强。同时，含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水中的mcp可以发挥促进细胞增殖等生物活性，尤其是促进软骨细胞增殖和维持软骨细胞表型的作用，可用于3d生物打印及工程化组织和器官的构建；本发明含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水的制备方法简单，原料来源广泛，便于规模化生产。
8、
1.一种含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水及其制备方法和应用，其特征在于它是以改性柑橘果胶与可3d打印的高分子水凝胶混合而成，改性柑橘果胶的质量体积终浓度范围在0.01%-1%可调。
2.根据权利要求1所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水材料，其特征是其主要包括以下组分：可3d打印的高分子水凝胶材料、光引发剂、改性柑橘果胶。
3.根据权利要求1所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水的及其制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1），将光引发剂加入至磷酸盐（pbs，ph，7.4）缓冲溶液中，水浴加热使其溶解，制成光引发剂溶液；（2），将高分子水凝胶材料分别加入至光引发剂溶液中，水浴加热至完全溶解，形成高分子水凝胶溶液；（3），将mcp加入至光引发剂溶液中，水浴加热至完全溶解，配制改性柑橘果胶溶液；（4），避光条件下，将上述步骤所得的高分子水凝胶溶液与改性柑橘果胶溶液混合，最终得到含改性柑橘果胶的复合水凝胶生物墨水材料。
4.根据权利要求1所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水，其特征是可3d打印的高分子水凝胶材料包括但不限于甲基丙烯酰化改性的明胶、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠等高分子水凝胶材料；所述的甲基丙烯酰胺化改性的明胶、透明质酸钠、海藻酸钠、壳聚糖等的终浓度在5-200mg/ml范围内可调。
5.根据权利要求1所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水的及其制备方法，所述的含改性柑橘果胶的复合水凝胶生物墨水材料中的分子水凝胶材料可以由上述高分子水凝胶材料单一组分制备而成，也可以通过多种高分子水凝胶材料的混合，组合制备复合高分子水凝胶。
6.根据权利要求2所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水的及其制备方法，所述的光引发剂可优先但不限于选用苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰次膦酸锂（lap，lithium phenyl-2 ,4 ,6-trimethylbenzoylphosphinate）。
7.根据权利要求1所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水，其特征在于它可以通过挤出方式进行3d打印，后通过紫外和/或可见光照射光交联方式进行固化处理，可优先选用波长为405nm的蓝光照射交联。
8.根据权利要求7所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水，其特征在于在避光条件下，将复合水凝胶生物墨水置于4℃冰箱中冷藏15min，即可用于3d打印。
9.根据权利要求7，所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水的光交联固化过程可选择逐层光照交联固化，也可以在打印完成后一次性照射交联固化。
10.根据权利要求1所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水，其特征在于复合水凝胶生物墨水可以单独进行3d打印，也可以与体外培养细胞混合后进行3d生物打印。
11.根据权利要求1所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水，其特征在于复合水凝胶生物墨水可以进一步复合生长因子等生物活性物质。
12.根据权利要求1所述的含改性柑橘果胶的可3d打印复合水凝胶生物墨水及其制备方法和应用，其特征在于该水凝胶复合材料主要应用于3d生物打印及组织工程人工组织、器官的构建。
