本发明属于生物，涉及生产阿卡波糖的菌株。
背景技术：
1、阿卡波糖(acarbose)是一种理想的ⅱ型糖尿病治疗药物。
2、通过微生物发酵法生产阿卡波糖是目前的主要生产方式，但有多种杂质伴随生成。其中，药典中对杂质a含量限度为0.6％。杂质a为阿卡波糖的同分异构体，与阿卡波糖结构极为接近。为达到标准，生产中需采用多步层析工艺去除，致使阿卡波糖纯化工艺复杂，收率低。专利cn108624544b公开了游动放线菌△mg-4，其发酵产物中杂质a含量为0.42％，在0.6％以内，但与药典规定的含量限度还是较为接近的。因此，进一步运用基因工程技术改造游动放线菌，提高阿卡波糖的产量、降低杂质a含量，从而降低成本，具有重要的意义。
技术实现思路
1、基于此，本发明申请人在专利cn108624544b的基础上，进一步对游动放线菌进行改造，获得了阿卡波糖高产菌株，提高阿卡波糖发酵单位的同时降低了杂质a的含量。
2、在第一个方面，本发明提供一种生产阿卡波糖的工程菌，所述工程菌是产阿卡波糖的游动放线菌中mall基因失活，其中，所述产阿卡波糖的游动放线菌是cn108624544b中的△
3、mg-4，所述mall基因编码的氨基酸序列如seq id no:2所示。
4、在一些优选的实施方式中，所述mall基因失活指mall基因缺失。进一步优选地，所述缺失为全部基因缺失或部分基因缺失。
5、在一种优选的实施方式中，所述mall基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述失活是seq id no:1所示序列中第111～1669位核苷酸缺失。
6、在一种优选的实施方式中，所述工程菌是游动放线菌△mg-4与片段p发生同源重组而形成，其中，片段p的核苷酸序列如seq id no:3所示。
7、在第二个方面，提供产阿卡波糖的工程菌的构建方法，包括将游动放线菌△mg-4中的mall基因失活，其中，所述mall基因编码的氨基酸序列如seq id no:2所示；优选地，所述mall基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
8、在一些优选的实施方式中，所述构建方法包括：将游动放线菌△mg-4与片段p发生同源重组，其中，片段p的核苷酸序列如seq id no:3所示。
9、优选地，所述同源重组是通过将游动放线菌△mg-4的菌丝与含有片段p的重组菌共同培养进行接合转移而完成。
10、本发明中所述的片段p，自5’端到3’端分别为同源臂t1和同源臂t2，同源臂t1和同源臂t2能够与mall基因发生同源重组，从而失活mall基因。
11、优选地，所述同源臂t1由mall基因编码序列的5’端110bp核苷酸和mall基因上游片段组成，同源臂t2由mall基因编码序列的3’端32bp核苷酸和mall基因下游片段组成。
12、所述片段p分别在同源臂t1和同源臂t2包含mall基因编码序列的5’端和3’端序列，但缺失mall基因中间一部分编码序列。当t1、t2与出发游动放线菌的mall基因的上下游发生同源重组，所述片段p将被重组至游动放线菌的基因组中；因其缺失mall基因的部分序列，使mall基因无法表达正常产物或不表达，从而使构建的游动放线菌中的mall基因中断失活。本领域技术人员可以理解，当mall基因的5’端和3’端分别被扩增后，需要将二者连接起来以形成完整的dna片段。通常情况下，本领域技术人员可使用限制性内切酶识别序列来连接两个片段或者采用无缝克隆试剂盒进行无缝拼接。限制性内切酶的选择、无缝克隆引物设计、pcr扩增以及扩增片段的回收和连接等都是本领域技术人员根据所使用的质粒、菌株和实验条件可以选择和判断的。
13、本发明方法通过构建包含dna片段p的质粒和重组菌，利用重组菌与出发游动放线菌同源重组而完成。本领域技术人员可以根据实验条件而选择合适的原始质粒和菌株，构建出合适的包含dna片段p的质粒和重组菌。
14、优选地，包含片段p的质粒为supamt-mall-ud，其构建过程包括：
15、(1)将载体supcosⅰ以hicⅱ+draⅰ双酶切，与质粒pij773以xbaⅰ+bstbⅰ双酶切后连接，得到载体supamt；
16、(2)以△mg-4的基因组为模板，以引物mallu-f(seq id no:4)和mallu-r(seq idno:5)进行扩增，产物与以xbaⅰ酶切的载体supamt连接，得到重组质粒supamt-mall-u；
17、(3)以△mg-4的基因组为模板，以引物malld-f(seq id no:6)和malld-r(seq idno:7)进行扩增，产物与以xbaⅰ酶切的supamt-mall-u连接，得到重组质粒supamt-mall-ud。
18、优选地，包含片段p的重组菌是et12567(puz8002,supamt-mall-ud)，其构建过程为：将质粒supamt-mall-ud转化到大肠杆菌et12567(puz8002)得到。
19、在一种优选的实施方式中，生产阿卡波糖的工程菌的构建方法包括将重组菌et12567(puz8002,supamt-mall-ud)与△mg-4进行接合转移，使片段p与mall基因发生同源重组而得到。
20、在第三个方面，本发明提供生产阿卡波糖的工程菌在制备阿卡波糖中的应用。
21、在第四个方面，本发明提供一种制备阿卡波糖的方法，所述方法包括发酵本发明的生产阿卡波糖的工程菌。
22、在第五个方面，本发明提供片段p、包含所述片段p的重组质粒或重组菌在构建生产阿卡波糖的工程菌中的应用，所述片段p的核苷酸序列如seq id no:3所示。
23、在第六个方面，本发明提供mall基因在构建杂质a组分降低的阿卡波糖工程菌中的应用，其中，所述mall基因编码的氨基酸序列如seq id no:2所示。优选地，所述mall基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
24、本发明的关键在于使氨基酸序列如seq id no:2所示的蛋白质无法正常表达，从而降低杂质a的含量，提高阿卡波糖的产量。因此，任何编码seq id no:2所示序列的核苷酸序列都视为mall基因。在本发明中，mall基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。本领域技术人员应当理解，与seq id no:1序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性、且编码序列如seq id no:2所示的氨基酸片段的核苷酸片段，都属于本发明的mall基因范围内。
25、本发明通过同源重组中断失活mall基因，获得的生产阿卡波糖工程菌经发酵，得到的阿卡波糖的发酵单位相较于出发菌株游动放线菌△mg-4，提高了24.7％；杂质a组分的含量由0.42％下降至约0.06％。本发明采用基因工程技术突破了传统菌种选育的盲目性，获得的菌株稳定性好，阿卡波糖产量大幅度提高，降低了生产成本，保证了产品质量，提高了经济效益。
1.一种生产阿卡波糖的工程菌，所述工程菌是产阿卡波糖的游动放线菌中mall基因失活，其中，所述mall基因编码的氨基酸序列如seq id no:2所示；优选地，所述产阿卡波糖的游动放线菌是cn108624544b中的△mg-4；优选地，所述mall基因失活指mall基因缺失；进一步优选地，所述mall基因失活是seq id no:1所示序列中第111～1669位核苷酸缺失。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其中，所述工程菌是游动放线菌△mg-4与片段p发生同源重组而形成，其中，片段p的核苷酸序列如seq id no:3所示。
3.权利要求1或2所述的生产阿卡波糖的工程菌的构建方法，包括将产阿卡波糖的游动放线菌中的mall基因失活，其中，所述mall基因编码的氨基酸序列如seq id no:2所示；优选地，所述产阿卡波糖的游动放线菌为△mg-4，所述mall基因的核苷酸序列如seq idno:1所示。
4.根据权利要求3所述的构建方法，包括：将游动放线菌△mg-4与片段p发生同源重组，其中，片段p的核苷酸序列如seq id no:3所示；优选地，所述同源重组是通过将游动放线菌△mg-4的菌丝与含有片段p的重组菌共同培养进行接合转移而完成。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其中，所述含有片段p的重组菌是et12567(puz8002,supamt-mall-ud)，其构建过程为：将质粒supamt-mall-ud转化到大肠杆菌et12567(puz8002)得到；
6.权利要求1或2所述的生产阿卡波糖的工程菌在制备阿卡波糖中的应用。
7.一种制备阿卡波糖的方法，包括发酵权利要求1或2所述的生产阿卡波糖的工程菌。
8.片段p、包含片段p的重组质粒或重组菌在构建生产阿卡波糖的工程菌中的应用，其中，所述片段p的核苷酸序列如seq id no:3所示。
9.mall基因在构建杂质a组分降低的阿卡波糖工程菌中的应用，其中，所述mall基因编码的氨基酸序列如seq id no:2所示；优选地，所述mall基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
