本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及不同类型新生儿肠道病毒的检测，更具体地，涉及肠道病毒d68型、副肠孤病毒a3型和埃可病毒30型的检测。
背景技术：
1、新生儿肠道病毒68型(ev-d68)属于新生儿肠道病毒d组一个血清型，其不在肠道寄居，而是感染呼吸道，因此只能从感染者的呼吸道分泌物中分离到这种病毒。新生儿肠道病毒d68引起的呼吸系统疾病，主要发生于儿童，症状通常类似感冒(如流涕，咳嗽，全身不适，少数出现发热)。部分儿童，特别是那些患有哮喘的儿童，可出现累及下呼吸道的严重症状。新生儿感染新生儿肠道病毒d68会出现类似脓毒血症的高热、乏力、dic、出血和多器官衰竭等表现。同时亦可见中枢神经系统、肝脏、胰腺和肾上腺损伤的表现，对新生儿健康存在严重威胁。
2、人副肠孤病毒(human parechovirus，hpev)属于小rna病毒科副肠孤病毒属，是一种无包膜、单链rna病毒。目前已发现16种不同亚型的hpev(hpev1～16)。新生儿为hpev感染的易感人群，占60％～73％，其中hpev3是儿童hpev感染的常见类型。hpev3感染主要通过粪-口和飞沫途径在密切接触的人群中传播，如在人源间交叉感染、社区感染和新生儿病房hpev暴发感染等。儿童hpev感染临床表现多样，可无症状或表现为轻微的呼吸、消化系统感染症状，也可表现为严重感染如心肌炎、肺炎、脑膜脑炎以及合并嗜血综合征等危重症。
3、人类埃可病毒30型(echovirus 30，echov 30)属小核糖核酸病毒科肠道病毒属，是人类肠道于新生儿肠道病毒b组一个血清型，echov 30无胞膜病毒，能在恶劣的环境条件(如高盐、高ph值和37℃)下稳定存活。由于人在感染人类新生儿肠道病毒后的几周内仍能从呼吸道和肠道中排出病毒，该病毒可引起病毒传播、感染甚至暴发流行等严重危害。在新生儿病毒性脑炎病例中，由echov 30病毒引起的病例占80％～93％，而echov 30是一种病毒性脑炎病例中最常分离到的新生儿肠道病毒。
4、因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述不同的病原体，以便为临床医生提供较为充分的快速诊断以及排除不同病原体感染的依据，缩短临床医生对患者病情诊断的时间，加快对患者实施治疗措施，并且灵敏度高，特异性好。
技术实现思路
1、有鉴于此，第一方面，本发明提供一种新生儿肠道病毒检测的组合物，包括：
2、如seq id no:1～3所示的检测肠道病毒d68型的上游引物、下游引物及探针；
3、如seq id no:4～6所示的检测副肠孤病毒a3型的上游引物、下游引物及探针；以及
4、如seq id no:7～9所示的检测埃可病毒30型的上游引物、下游引物及探针。
5、本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光pcr分析方法，通过检测不同靶点，对不同类型的病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实肠道病毒d68型、副肠孤病毒a3型、埃可病毒30型的检测和区分，以便为后续治疗提供针对性的策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/ml，特异性好，检测更为准确。
6、进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。
7、在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是rnase p。
8、在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括如seq id no:10～12所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。
9、进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
10、在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用atto425、quasar705、fam、hex、rox和cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
11、在一些具体的实施方案中，肠道病毒d68型探针的荧光报告基团为fam；副肠孤病毒a3型探针的荧光报告基团为hex；埃可病毒30型探针的荧光报告基团为cy5；内标探针的荧光报告基团为cy5。
12、进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
13、本发明的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。
14、举例来说，上述4对引物和探针中的任意3对，可以包括上述4对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述4对引物和探针中的任意1对。
15、在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光pcr。
16、进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。
17、进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如bhq1或bhq2。
18、在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为bhq1。
19、在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
20、在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
21、进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
22、第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备新生儿肠道病毒检测的试剂盒中的用途。
23、第三方面，本发明提供了一种检测新生儿肠道病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
24、进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
25、在一个具体的实施方案中，阴性质控品是depc h2o、生理盐水、内标基因中的至少一种。阳性质控品是肠道病毒d68型、副肠孤病毒a3型、埃可病毒30型的片段核酸、假病毒等中的至少一种。
26、进一步地，所述试剂盒还包括dntp、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。
27、更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂，逆转录酶，以及dna聚合酶中的至少一种。
28、更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dntp、dutp、ung酶、逆转录酶、dna聚合酶、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。
29、进一步地，所述逆转录酶的浓度为5u/反应～15u/反应，例如逆转录酶可以是neoscript rt逆转录酶；进一步地，所述dna聚合酶的浓度为3u/反应～15u/反应，例如dna聚合酶可以是taq酶。
30、在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括反/逆转录酶、taq酶、mg2+、dntp(u)s、引物、探针和pcr缓冲液。
31、常见的pcr缓冲液由tris-hcl、mgcl2、kcl、triton x-100等缓冲体系构成。一般单个pcr反应管中总体积为20μl～200μl。
32、在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字pcr扩增体系，即可以直接用于数字pcr仪上进行扩增。
33、第四方面，提供了一种非诊断目的检测新生儿肠道病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
34、1)提取或释放待测样本的核酸；
35、2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；
36、3)获得并分析结果。
37、在本发明中，用于检测的样本可以是呼吸道分泌物等，但不限于此。
38、进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：
39、逆转录，温度为40～60℃，时间为30min，1次循环；taq酶活化，温度为95℃，时间为1～3min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
40、在一个具体的实施方案中，提供了一种组合物用于制备新生儿肠道病毒检测试剂的用途，所述检测包括以下步骤：
41、1)提取或释放待测样本的核酸；
42、2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；
43、3)获得并分析结果。
44、进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：
45、逆转录，温度为40～60℃，时间为30min，1次循环；taq酶活化，温度为95℃，时间为1～3min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
1.一种新生儿肠道病毒检测的组合物，包括：
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括如seq id no:10～12所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，肠道病毒d68型探针的荧光报告基团为fam；副肠孤病毒a3型探针的荧光报告基团为hex；埃可病毒30型探针的荧光报告基团为cy5；内标探针的荧光报告基团为cy5。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备检测新生儿肠道病毒的试剂盒中的用途。
7.一种检测新生儿肠道病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～5中任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂、逆转录酶、dna聚合酶、dntp、dutp、ung酶、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。
10.一种组合物用于制备新生儿肠道病毒检测的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：
