本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一种提高植物乙烯释放量的方法。
背景技术：
1、乙烯是植物生长发育的重要调控激素，尤其对香蕉、苹果、番茄等呼吸跃变型果实成熟至关重要。外源乙烯处理可以促进果实成熟，形成果实特有的色泽、风味、质地、芳香和营养品质。商业生产过程中，通常采用施加乙烯的稳定替代物乙烯利溶液的方式促进果实成熟，操作期间，不仅耗费大量劳动力与经济投入，还易造成果实的机械损伤与病菌腐败，降低了果实的商业价值。因此，研究发现能够促进乙烯释放水平的基因，对实现果实成熟控制与品质保持具有重要意义。
2、酸式还原酮加双氧酶ard。涉及非种子植物地钱(拉丁学名：marchantiapolymorpha)的酸式还原酮双加氧酶(英文名：acireductone dioxygenase)，命名为mpard。利用生物技术发现地钱植物中酸式还原酮双加氧酶mpard，通过crispr/cas9基因编辑技术促使该基因发生突变后，可促进植物乙烯释放量水平。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种提高植物乙烯释放量的方法，通过以下步骤实现：
2、1.酸式还原酮双加氧酶mpard，其基因组序列如seq id no.1所示，其蛋白氨基酸序列如seq id no.2所示；其编码区由600个核苷酸碱基对组成，蛋白质由199个氨基酸残基构成。根据mpard基因序列设计向导rna，序列seq id no.3和seq id no.10，以pmpge_en03载体为模板，用引物扩增mpu6-1序列，用引物扩增grna骨架，将纯化后片段通过一步连接反应试剂盒克隆至被maubi和aflii限制性内切酶线性化后的ge010载体中。用一步连接得到的产物进行大肠杆菌载体转化，获得mpard基因crispr/cas9向导rna基因敲除载体，将正确载体转化农杆菌。将农杆菌单克隆接菌至lb液体培养基中培养2天，离心后，用1/2gamborg’s b5、1％(w/v)蔗糖和100μm乙酰丁香酮液体培养基重悬，黑暗温度28℃摇床活化6hr后获得农杆菌转化菌液；
3、2.将野生型地钱胞芽种植于无菌培养基上14天，将分生区在内的组织切除后，将剩余叶状体组织一分为四，继续在1/2gamborg’s b5，1％(w/v)蔗糖和1.3％琼脂的培养基上生长3天。在含有2％蔗糖和100μm乙酰丁香酮的gamborg’s b5液体培养基和再生叶状体中，添加上述制备活化完成的农杆菌转化菌液，共培养3天。将共培养组织用无菌水清洗，然后浸泡在含有1g/l的头孢噻肟无菌水中30min。将叶状体组织置于含有1.3％琼脂、10mg/l潮霉素和100mg/l头孢噻肟的1/2gamborg’s b5培养基上筛选。转化当代阳性植物筛选产生胞芽后，继续在潮霉素培养基上筛选一代。提取基因组dna测序比对筛选发生基因编辑的突变体植物，获得不同mpard蛋白突变类型，序列seq id no.13，seq id no.14，seq id no.15和seq id no.16；
4、3.将野生型与突变体植物材料培育于恒温23℃组织培养室，光照条件为光16hr暗8hr。将10天大的野生型植物和mpard突变体植物放入内含1/2gamborg’s b5和1％(w/v)蔗糖的液体培养基的顶空瓶中，置于原生长环境中一段时间后，利用气相色谱法测定乙烯生成量。根据气相色谱测得顶空中乙烯释放量，计算单位重量的植物乙烯释放水平。
5、本发明提供了2个crispr/cas9向导rna基因编辑靶点和基因编辑载体，本发明提供了4种mpard蛋白突变类型。
6、本发明提供了一个酸式还原酮双加氧酶编码基因mpard基因及其序列、cds序列、蛋白序列，该基因来源于地钱。通过分别设计2个向导rna基因编辑靶点引物，构建crispr/cas9载体，遗传转化获得转基因植物，发现mpard基因4种不同突变型的植物乙烯释放量由0.395μl/hr/g fw上升至1.131μl/hr/g fw与1.184μl/hr/g fw之间，或由0.237μl/hr/g fw上升至0.690μl/hr/g fw与0.788μl/hr/g fw之间，增幅约为3倍。可利用基因编辑酸式还原酮双加氧酶mpard基因的方法提升植物乙烯释放量。
1.一种提高植物乙烯释放量的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增mpu6-1序列的引物为seq id no.4和seq id no.5，扩增grna骨架的引物为seq id no.6和seq id no.7。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，权利要求1提供2个crispr/cas9向导rna基因编辑靶点，其序列seq id no.3和seq id no.10，及其对应的基因编辑载体，提供4种mpard蛋白突变类型，其序列为seq id no.13，seq id no.14，seq id no.15和seq idno.16。
4.权利要求1所述方法在提高植物乙烯释放量中应用，其特征在于，所述植物为地钱。
