本发明涉及维生素分析检测，具体涉及一种母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法。
背景技术：
1、母乳是哺乳期婴儿的唯一营养来源，在婴儿的生长发育过程中至关重要，婴儿的营养来源完全依靠母乳来提供，因此母乳中营养素含量是否满足哺乳期婴儿成长所需就显得尤为重要。
2、维生素d在婴儿成长过程中对骨骼生长、头脑发育以及免疫系统发育发挥着重要作用。缺乏维生素d的婴儿可引起钙、磷的吸收障碍以及骨骼和牙齿的发育，从而影响身体发育，严重时还会影响免疫系统，造成免疫系统疾病和佝偻病等。在母体中维生素d主要以维生素d3和d2形式存在，然而维生素d3在体内迅速转化为25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3和1,25-二羟基维生素d3。
3、母乳中的维生素d的含量会随季节而发生变化，研究表明通过阳光照射或uv-b暴露能够增加25-羟基维生素d的含量。由于母乳中25-羟基维生素d能够反映出母体中维生素d的储存情况，为了能够减少婴儿缺乏维生素d的情况出现，并且该方法不需要经过复杂的采血测定，能够简单快速测定母乳中25-羟基维生素d的总量，能够让婴儿母亲知晓自身母乳中维生素d的含量储存情况，并及时做出相应的调整和改善。
4、目前的研究中很少有检测母乳中25-羟基维生素d总量的方法，多数是检测血清中25-羟基维生素d的方法，如cn108645942a公开了一种血清中25-羟基维生素d的高效液相色谱串联质谱检测方法，在该方法中，仅对血清样品进行简单的预处理和固液萃取，即预处理：血清样品依次加入内标工作液和氢氧化钠溶液；固液萃取：预处理样品上样到sle96孔板上，静置5min，再将1～2ml正己烷分四次加入sle96孔板进行洗脱，这种预处理方式较为适用于血清中待测物的提取；而由于母乳中成分更为复杂，含有多种蛋白质、糖类和脂类化合物，直接将其转用，发现该提取方法难于将这些物质全部除掉，无法得到澄清的待测液，且会产生较为严重的基质效应。
5、因此，亟待建立一种适用于母乳中25-羟基维生素d总量的测定方法。
6、有鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法，所述检测方法具体包括以下步骤：将母乳样品、内标工作液和第一提取剂混合，进行第一提取，得到沉淀物和第一提取液；所述第一提取剂中包括抗氧化剂、甲醇和乙腈；将沉淀物和第二提取剂混合，进行第二提取，得到第二提取液；所述第二提取剂中包括甲基叔丁基醚、正己烷和乙酸乙酯；将第一提取液和第二提取液混合后，进行衍生化反应，得到待测样品；将待测样品进行复溶，得到待测样品溶液；采用高效液相色谱串联质谱对所述待测样品溶液进行检测，得到所述母乳中25-羟基维生素d总量。所述检测方法通过特定的提取剂更好地除去多种蛋白质、糖类和脂类化合物，将待测化合物从成分复杂的母乳样品中提取并净化，提高了方法的检测灵敏度和选择性，有效地减少了样本中复杂基质有可能引入的干扰。
2、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法，所述检测方法具体包括以下步骤：
4、将母乳样品、内标工作液和第一提取剂混合，进行第一提取，得到沉淀物和第一提取液；所述第一提取剂中包括抗氧化剂、甲醇和乙腈；
5、将沉淀物和第二提取剂混合，进行第二提取，得到第二提取液；所述第二提取剂中包括甲基叔丁基醚、正己烷和乙酸乙酯；
6、将第一提取液和第二提取液混合后，进行衍生化反应，得到待测样品；
7、将待测样品进行复溶，得到待测样品溶液；
8、采用高效液相色谱串联质谱对所述待测样品溶液进行检测，得到所述母乳中25-羟基维生素d总量。
9、本发明的目的是提供一种快速测定母乳中25-羟基维生素d总量的方法，其可快速检测25-羟基维生素d的总量及代谢产物25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3和1,25-二羟基维生素d3的含量。
10、在本发明中，通过采用特定的提取剂以及特定的提取步骤，更好地除去多种蛋白质、糖类和脂类化合物，将待测化合物从成分复杂的母乳样品中提取并净化，极大地降低了体系的基质效应，提高了方法的检测灵敏度和选择性。此外，衍生化以后检测目标化合物带上特异性基团使待测化合物极性变大，出峰时间更早，缩短了单个样本的检测时间，还可以使待测物离子化效果更好，从而进一步地提高灵敏度。
11、优选地，所述母乳样品、内标工作液和第一提取剂的质量比为1:(0.005～0.5):(0.5～5)；
12、其中，“0.005～0.5”例如可以是0.005、0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5等；
13、其中，“0.5～5”例如可以是0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5等。
14、优选地，所述内标工作液中包括25-羟基维生素d3-[d3]、25-羟基维生素d2-[d6]和1,25-二羟基维生素d3-[d3]。
15、由于在母体中维生素d主要以维生素d3和d2形式存在，然而维生素d3在体内迅速转化为25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3和1,25-二羟基维生素d3，基于此，本发明内标工作液中包括25-羟基维生素d3-[d3]、25-羟基维生素d2-[d6]和1,25-二羟基维生素d3-[d3]，使其可快速、准确地检测25-羟基维生素d的总量及代谢产物25-羟基维生素d3、25-羟基维生素d2和1,25-二羟基维生素d3的含量。
16、其中，25-羟基维生素d3的结构式如下所示：
17、
18、其中，25-羟基维生素d2的结构式如下所示：
19、
20、优选地，所述内标工作液按质量浓度计包括：5～15ng/ml的25-羟基维生素d3-[d3]、5～15ng/ml的25-羟基维生素d2-[d6]、5～15ng/ml的1,25-二羟基维生素d3-[d3]。
21、在所述内标工作液中，25-羟基维生素d3-[d3]的含量为5～15ng/ml，例如可以是5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml等。
22、在所述内标工作液中，25-羟基维生素d-[d6]的含量为5～15ng/ml，例如可以是5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml等。
23、在所述内标工作液中，1,25-二羟基维生素d3-[d3]的含量为5～15ng/ml，例如可以是5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml等。
24、优选地，所述内标工作液的溶剂为含0.05～0.5wt％(例如可以是0.05wt％、0.06wt％、0.07wt％、0.08wt％、0.09wt％、0.1wt％、0.11wt％、0.12wt％、0.15wt％、0.2wt％、0.25wt％、0.3wt％、0.35wt％、0.4wt％、0.45wt％、0.5wt％等)的抗氧剂的甲醇溶液。
25、优选地，所述内标工作液的溶剂中的抗氧剂为2,6-二叔丁基对甲酚(bht)。
26、优选地，所述第一提取剂中包括含0.05～0.5wt％(例如可以是0.05wt％、0.06wt％、0.07wt％、0.08wt％、0.09wt％、0.1wt％、0.11wt％、0.12wt％、0.15wt％、0.2wt％、0.25wt％、0.3wt％、0.35wt％、0.4wt％、0.45wt％、0.5wt％等)的抗氧剂的甲醇溶液。
27、优选地，在所述第一提取剂中，含0.05～0.5wt％的抗氧剂的甲醇溶液和乙腈的质量比为1:(5～15)，例如可以是1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15等。
28、优选地，所述第一提取剂中的抗氧剂为2,6-二叔丁基对甲酚(bht)。
29、优选地，所述第一提取具体包括以下步骤：
30、先将母乳样品、内标工作液和含0.05～0.5wt％的抗氧剂的甲醇溶液混合，进行涡旋；再向该体系中添加乙腈，进行超声提取；再进行离心处理，得到沉淀物和上清液；其中，所述上清液为第一提取液。
31、优选地，所述涡旋的转速为500～3500r/min，例如可以是500r/min、1000r/min、1500r/min、2000r/min、2500r/min、3000r/min、3500r/min等，涡旋的时间为20～40s，例如可以是20s、22s、24s、26s、28s、30s、32s、34s、36s、38s、40s等。
32、优选地，所述超声提取的功率10～100w，例如可以是10w、20w、30w、40w、50w、60w、70w、80w、90w、100w等，超声提取的温度为1～10℃，例如可以是1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃等，超声提取的时间为5～15min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
33、优选地，所述离心处理的转速为8000～12000r/min，例如可以是8000r/min、8500r/min、9000r/min、9500r/min、10000r/min、10500r/min、11000r/min、11500r/min、12000r/min等，离心处理的时间为5～15min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
34、优选地，所述沉淀物和第二提取剂的质量比为1:(5～15)，例如可以是1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15等。
35、优选地，所述第二提取剂由体积比为(1～3):(0.5～2):(0.5～2)的甲基叔丁基醚、正己烷和乙酸乙酯组成；
36、其中，“1～3”例如可以是1、1.2、1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3等；
37、其中，第一个“0.5～2”例如可以是0.5、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2等；
38、其中，第二个“0.5～2”例如可以是0.5、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2等。
39、作为本发明一优选实施方案，所述基叔丁基醚、正己烷和乙酸乙酯的体积比为2:1:1。
40、优选地，所述第二提取具体包括以下步骤：
41、先将沉淀物和第二提取剂混合，进行超声提取；再进行离心处理，得到沉淀物和上清液；其中，所述上清液为第二提取液。
42、优选地，所述超声提取的功率10～100w，例如可以是10w、20w、30w、40w、50w、60w、70w、80w、90w、100w等，超声提取的温度为1～10℃，例如可以是1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃等，超声提取的时间为5～15min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
43、优选地，所述离心处理的转速为8000～12000r/min，例如可以是8000r/min、8500r/min、9000r/min、9500r/min、10000r/min、10500r/min、11000r/min、11500r/min、12000r/min等，离心处理的时间为5～15min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
44、优选地，所述衍生化反应前还需进行浓缩处理，浓缩处理至浓缩物的含液量在0.5wt％以下，例如可以是0.5wt％、0.45wt％、0.4wt％、0.35wt％、0.3wt％、0.25wt％、0.2wt％、0.15wt％、0.1wt％、0wt％等。
45、优选地，所述浓缩处理采用氮吹法进行。
46、优选地，所述浓缩处理在避光水浴氮吹仪中进行。
47、优选地，所述浓缩处理中，水浴的温度为25～35℃，例如可以是25℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、35℃等。
48、优选地，所述浓缩处理中，氮气压力为0.05～0.5mpa，例如可以是0.05mpa、0.1mpa、0.15mpa、0.2mpa、0.25mpa、0.3mpa、0.35mpa、0.4mpa、0.45mpa、0.5mpa等。
49、优选地，所述衍生化采用的衍生化试剂为4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(ptad)。
50、其中，ptad的结构式如下所示：
51、
52、优选地，所述衍生化反应具体包括以下步骤：
53、将第一提取液和第二提取液混合后，进行浓缩处理；再将浓缩处理后得到的浓缩物与含ptad的乙腈溶液混合，进行衍生化反应。
54、优选地，所述浓缩物与ptad的质量比为(1～5):(1～5)；
55、其中，第一个“1～5”例如可以是1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5等；
56、其中，第二个“1～5”例如可以是1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5等。
57、优选地，所述含ptad的乙腈溶液的质量浓度为40～60μg/ml，例如可以是40μg/ml、42μg/ml、44μg/ml、46μg/ml、48μg/ml、50μg/ml、52μg/ml、54μg/ml、56μg/ml、58μg/ml、60μg/ml等。
58、优选地，所述衍生化反应的温度为20～30℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等，衍生化反应的时间为20～40min，例如可以是20min、22min、24min、26min、28min、30min、32min、34min、36min、38min、40min等。
59、优选地，所述衍生化反应后还需进行浓缩处理，浓缩处理至浓缩物的含液量在0.5wt％以下，例如可以是0.5wt％、0.45wt％、0.4wt％、0.35wt％、0.3wt％、0.25wt％、0.2wt％、0.15wt％、0.1wt％、0wt％等；其中，所述浓缩物为待测样品。
60、在上述衍生化反应后所进行浓缩处理与衍生化反应前所进行浓缩处理可以采用相同的步骤进行。
61、优选地，所述待测样品和复溶溶剂的质量比为1:(0.1～1)，例如可以是1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1等。
62、优选地，所述复溶采用的复溶溶剂包括甲酸的水溶液和甲醇。
63、优选地，所述甲酸的水溶液和甲醇体积比为(5～7):(3～5)；
64、其中，“5～7”例如可以是5、5.2、5.5、5.8、6、6.2、6.5、6.8、7等；
65、其中，“3～5”例如可以是3、3.2、3.5、3.8、4、4.2、4.5、4.8、5等。
66、作为本发明一优选实施方案，所述甲酸的水溶液和甲醇体积比为6:4。
67、优选地，在所述甲酸的水溶液中，甲酸的含量为0.05～0.2wt％,例如可以是0.05wt％、0.06wt％、0.07wt％、0.08wt％、0.09wt％、0.1wt％、0.11wt％、0.12wt％、0.15wt％、0.2wt％等。
68、优选地，所述复溶具体包括以下步骤：
69、采用所述复溶溶剂溶解待测样品，进行离心处理，得到上清液；其中，所述上清液为待测样品溶液。
70、优选地，所述复溶溶剂的温度为1～10℃，例如可以是1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃等。
71、优选地，所述离心处理的转速为8000～12000r/min，例如可以是8000r/min、8500r/min、9000r/min、9500r/min、10000r/min、10500r/min、11000r/min、11500r/min、12000r/min等，离心处理的时间为5～15min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
72、优选地，在所述检测中，所述色谱柱采用acquity uplc hss t3色谱柱。
73、优选地，所述色谱柱的规格为：柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.8μm。
74、优选地，所述色谱柱的柱温为30～40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。
75、优选地，在所述检测中，流动相a为甲酸铵的水溶液，流动相b为甲酸的甲醇溶液。
76、优选地，所述流动相a的ph为5～5.5，例如可以是5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5等。
77、优选地，在所述流动相a中，甲酸铵的浓度为8～12mmol/l，例如可以是8mmol/l、8.5mmol/l、9mmol/l、9.5mmol/l、10mmol/l、10.5mmol/l、11mmol/l、11.5mmol/l、12mmol/l等。
78、优选地，在所述流动相b中，甲酸的含量为0.05～0.2wt％，例如可以是0.05wt％、0.06wt％、0.07wt％、0.08wt％、0.09wt％、0.1wt％、0.11wt％、0.12wt％、0.15wt％、0.2wt％等。
79、优选地，在所述检测中，色谱条件的洗脱条件如下所示：
80、
81、
82、优选地，在所述检测中，质谱的条件参数为：采用mrm多反应监测模式，esi+离子扫描，离子源温度115～125℃(例如可以是115℃、116℃、118℃、120℃、122℃、125℃等)，毛细管电压2.5～3.5kv(例如可以是2.5kv、2.6kv、2.8kv、3kv、3.2kv、3.4kv、3.5kv等)，脱溶剂温度350～450℃(例如可以是350℃、360℃、380℃、400℃、420℃、440℃、450℃等)，脱溶剂流量750～850l/h(例如可以是750l/h、760l/h、780l/h、800l/h、820l/h、840l/h、850l/h等)。
83、作为本发明一优选实施方案，所述母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法具体包括以下步骤：
84、s1、第一次提取：先将母乳样品、内标工作液和含抗氧剂的甲醇溶液混合，进行涡旋；再向该体系中添加乙腈，进行超声提取；再进行离心处理，得到沉淀物和上清液；其中，所述上清液为第一提取液；
85、s2、第二次提取：先将沉淀物和第二提取剂混合，进行超声提取；再进行离心处理，得到沉淀物和上清液；其中，所述第二提取剂中包括甲基叔丁基醚、正己烷和乙酸乙酯；所述上清液为第二提取液；
86、s3、衍生化：将第一提取液和第二提取液混合后，进行第一次浓缩处理；再将浓缩处理后得到的浓缩物与含ptad的乙腈溶液混合，进行衍生化反应，最后再进行第二次浓缩处理，得到待测样品；
87、s4、复溶：采用所述复溶溶剂溶解待测样品，进行离心处理，得到上清液；其中，所述复溶采用的复溶溶剂包括甲酸的水溶液和甲醇；所述上清液为待测样品溶液；
88、s5、检测：采用高效液相色谱串联质谱对所述待测样品溶液进行检测，得到所述母乳中25-羟基维生素d总量。
89、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
90、本发明所述检测方法通过特定的提取剂更好地除去多种蛋白质、糖类和脂类化合物，将待测化合物从成分复杂的母乳样品中提取并净化，提高了方法的检测灵敏度和选择性，有效地减少了样本中复杂基质有可能引入的干扰。此外，衍生化以后检测目标化合物带上特异性基团使待测化合物极性变大，出峰时间更早，缩短了单个样本的检测时间，还可以使待测物离子化效果更好，从而进一步地提高灵敏度。
1.一种母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法，其特征在于，所述第一提取剂中包括乙腈；
3.根据权利要求1或2所述的母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法，其特征在于，所述第一提取剂中还包括含0.05～0.5wt％的抗氧剂的甲醇溶液；
4.根据权利要求1所述的母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法，其特征在于，所述第二提取剂中包括甲基叔丁基醚、正己烷和乙酸乙酯；
5.根据权利要求1所述的母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法，其特征在于，所述衍生化反应前还需进行浓缩处理，浓缩处理至浓缩物的含液量在0.5wt％以下；
6.根据权利要求1或5所述的母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法，其特征在于，所述衍生化反应具体包括以下步骤：
7.根据权利要求1所述的母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法，其特征在于，所述待测样品和复溶溶剂的质量比为1:(0.1～1)；
8.根据权利要求1所述的母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法，其特征在于，在所述检测中，色谱柱采用acquity uplc hss t3色谱柱；
9.根据权利要求1或8所述的母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法，其特征在于，在所述检测中，流动相a为甲酸铵的水溶液，流动相b为甲酸的甲醇溶液；
10.根据权利要求1所述的母乳中25-羟基维生素d总量的检测方法，其特征在于，在所述检测中，质谱的条件参数为：采用mrm多反应监测模式，esi+离子扫描，离子源温度115～125℃，毛细管电压2.5～3.5kv，脱溶剂温度350～450℃，脱溶剂流量750～850l/h。
