本发明属于生物化学制药，具体涉及一种控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法。
背景技术：
1、肝素是从哺乳动物组织中提取的一种硫酸化的糖胺聚糖类化合物，其分子结构极其复杂，分子量从3kd～30kd不等，目前只有来源于猪小肠粘膜的肝素能用于临床治疗。肝素类药物主要用于预防和治疗深静脉血栓、血液透析抗凝，以及用于外科手术抗凝、急性冠状动脉综合症、缺血性脑血栓等疾病，此外还可用于妇产科、儿科、呼吸科、肿瘤、烧伤科等相关疾病的治疗。
2、二十世纪八十年代中期，欧洲首先开发出低分子肝素，低分子肝素比普通肝素具有更高的抗fxa/抗fⅱa效价比，因而能大大减少抗血栓过程中造成的出血倾向，目前临床上得到更广泛的应用。
3、常见的低分子肝素包括依诺肝素钠、那屈肝素钙、达肝素钠、帕肝素钠等，其中达肝素钠的标准为：重均分子量为5600～6400，分子量＜3000的级分≤13.0％，分子量＞8000的级分占15.0％～25.0％，其是将肝素钠用亚硝酸钠裂解制得，主要工艺步骤包括：亚硝酸钠裂解、超滤或纯化、醇沉、固液分离、干燥或冻干等。
4、在达肝素钠的生产过程中，最难之处在于控制其分子量及分布，纯化是控制分子量最关键的步骤。目前，越来越多学者关注达肝素钠的纯化工艺研究。例如：专利文献cn104072635a公开了一种用阴离子交换树脂纯化制备达肝素钠的方法，该方法包括如下步骤：(1)将阴离子交换树脂进行装柱，采用碱性混合液对树脂进行再生；(2)先采用纯化水对树脂清洗，然后用氯化钠溶液平衡树脂；(3)将达肝素钠粗品溶于纯化水中,上样，再用氯化钠溶液进行冲洗；(4)采用氯化钠溶液进行洗脱；(5)洗脱完毕后，采用纯化水冲洗层析柱；(6)洗脱液用乙醇沉淀，减压干燥得到符合质量标准的达肝素钠原料药。该方法通过采用溶液浓度及ph值均在最佳范围内的氯化钠溶液进行制备过程中的平衡、冲洗和洗脱，既保证了产品分子量分布符合达肝素钠标准要求，又具有较高的纯度和收率，保证了达肝素钠产品质量。
5、专利文献cn113024689a公开了一种达肝素钠分子量的控制方法。该控制方法是通过一次降解、层析纯化、二次降解、还原、脱色及干燥制得达肝素钠成品。该方法通过一次降解的将分子量控制在6900～7500之间，层析纯化之后将再将本应去除的大分子部分进行第二次降解，充分利用了肝素钠原料，使达肝素钠收率明显提高，收率达85％以上。而且该方法操作简单易行，对分子量及分子量分布控制准确，所有工序均在常温常压下进行，离子交换工艺易于生产放大，重现性好，具有重要的应用前景。
6、目前国内外厂家在裂解时均需要控制裂解液的分子量，且不同厂家和批号的肝素钠原料也会对分子量控制产生影响，进而更加需要通过反复调整补加亚硝酸钠用量和增加中控检测的方法来控制裂解液的分子量，才能进行后续的纯化步骤。然而，现阶段的纯化工艺，对裂解液的分子量大小控制要求很高，需要控制在较小的范围内，导致达肝素钠的生产周期长，操作复杂，生产成本高。
技术实现思路
1、针对目前达肝素钠纯化生产过程中需要严格控制裂解液分子量的问题，本发明的目的在于提供一种简单方便、可操作性强的控制达肝素钠分子量的纯化方法，以提高达肝素钠的生产效率，降低工艺复杂性，降低生产检测成本，从而提高达肝素钠的经济效益。
2、为了达到上述目的，本发明采用了如下技术方案：
3、本发明提供了一种控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法，以肝素钠为原料，经过裂解后得到裂解液进行纯化，控制分子量，再经过后续的生产工艺，得到分子量合格的达肝素钠，具体包括以下步骤：
4、步骤s1：将肝素钠加水溶解，调节ph后，加入肝素钠质量1.5～3.0％的亚硝酸钠裂解，然后经过氧化还原，得裂解液，检测分子量；
5、步骤s2：将步骤s1制得的裂解液进行稀释，使其浓度为20～80g/l，得稀释裂解液；
6、所述稀释后的裂解液可以直接用于纯化，无需进行醇沉过滤和复溶。
7、步骤s3：配制浓度为0～0.2mol/l的氯化钠溶液为淋洗液a，所述淋洗液a的电导率为0～20ms/cm，配制浓度为1.2～1.8mol/l的氯化钠溶液为淋洗液b，所述淋洗液b的电导率为100～180ms/cm；
8、所述制备淋洗液时，无需控制ph值，本发明提供的控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法不受ph值变化的影响。
9、步骤s4：将步骤s2得到的稀释裂解液上样至已经清洗平衡好的纯化柱上，启用双泵，分别采用步骤s3制得的淋洗液a和淋洗液b进行梯度洗脱，根据裂解液重均分子量大小，调整淋洗液a与淋洗液b的比例，在冲洗阶段，控制淋洗液的电导率为20～60ms/cm，冲洗至紫外吸收为0；
10、步骤s5：平衡2个柱体积，采用步骤s3制得的淋洗液a和淋洗液b进行洗脱，根据裂解液重均分子量大小，控制洗脱液的电导率为80～130ms/cm，收集洗脱峰，即得到重均分子量及分子量分布符合标准的达肝素钠纯化收集液，除盐、紫外照射、冻干后，即得到达肝素钠成品。
11、进一步地，所述步骤s1中水的添加量是肝素钠质量的3～10倍。
12、进一步地，所述步骤s1中的ph调节为1.0～3.0。
13、进一步地，所述步骤s1中亚硝酸钠的用量为肝素钠质量的2.0～2.8％。
14、进一步地，所述步骤s2中裂解液稀释后的浓度为30～50g/l。
15、进一步地，所述步骤s3中淋洗液a的电导率为10～20ms/cm，淋洗液b的电导率为120～150ms/cm。
16、进一步地，所述步骤s4中的冲洗阶段，当裂解液的重均分子量在4000～5000范围内时，淋洗液的电导率为50～60ms/cm，所述淋洗液中淋洗液b的体积为40～45％；当裂解液的重均分子量在5000～6000范围内时，淋洗液的电导率为40～50ms/cm，所述淋洗液中淋洗液b的体积为35～40％；当裂解液的重均分子量在6000～7000范围内时，淋洗液的电导率为30～40ms/cm，所述淋洗液中淋洗液b的体积为30～35％。
17、进一步地，所述步骤s5中所述的洗脱阶段，当裂解液的重均分子量在4000～5000范围内时，淋洗液的电导率为110～125ms/cm，所述淋洗液中淋洗液b的体积为90～100％；当裂解液的重均分子量在5000～6000范围内时，淋洗液的电导率为95～110ms/cm，所述淋洗液中淋洗液b的体积为80～90％；当裂解液的重均分子量在6000～7000范围内时，淋洗液的电导率为80～95ms/cm，所述淋洗液中淋洗液b的体积为70～80％。
18、目前，基于肝素钠的上游原料猪小肠粘膜与制造工艺不同，导致不同产家和不同批次的肝素钠原料在分子量大小及分布方面存在较大的差异，为了避免肝素钠裂解液的分子量影响后续的纯化步骤，需将裂解液的分子量控制在目标重均分子量±150左右。现有技术一般是通过增加或者减少亚硝酸钠的用量，增加中控的方法来控制裂解液的分子量范围，在控制过程中需要反复调节和检测，操作复杂，且生产检测耗时长。
19、为了解决上述技术问题，发明人首次提出采用梯度洗脱的方法用于控制达肝素钠的分子量及分布。本发明是采用淋洗液的电导率为主要指标，针对不同分子量的裂解液，通过梯度洗脱方法，控制淋洗液的电导率，进而可以针对不同的分子量的裂解液，精确控制淋洗液的电导率，纯化时可以稳定且精确的控制分子量，得到分子量分布稳定且符合质量标准的达肝素钠，不仅提高了产品质量的稳定性，而且对于裂解液的分子量无需严格控制，无需反复调节，大大降低了生产难度和生产成本。
20、本发明提供的控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法具体是：根据裂解液分子量大小，调整淋洗液a与淋洗液b的比例，控制洗涤和洗脱时淋洗液的电导率，其中淋洗液a与淋洗液b之间的任意电导率，可以精确的匹配不同分子量大小的裂解液，降低了裂解液的分子量控制要求，提高了工艺设计区间。经实验数据证实，该控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法在裂解液分子量大小为4000～7000区间内，均能得到分子量及分子量分布符合标准的达肝素钠产品。
21、与现有技术相比，本发明提供的控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法无需进行裂解液复杂的分子量中控操作，无需考虑原料肝素钠的不同厂家和不同批号对裂解和纯化工艺的影响，可极大减少裂解时的生产检测时间和各项成本，即使在很大的裂解液分子量区间内，也均能得到符合要求的达肝素钠，是一种较为理想的达肝素钠的纯化方法。
1.一种控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法，其特征在于，所述步骤s1中水的添加量是肝素钠质量的3～10倍。
3.如权利要求1所述的控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法，其特征在于，所述步骤s1中的ph调节为1.0～3.0。
4.如权利要求1所述的控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法，其特征在于，所述步骤s1中亚硝酸钠的用量为肝素钠质量的2.0～2.8％。
5.如权利要求1所述的控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法，其特征在于，所述步骤s2中裂解液稀释后的浓度为30～50g/l。
6.如权利要求1所述的控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法，其特征在于，所述步骤s3中淋洗液a的电导率为10～20ms/cm，淋洗液b的电导率为120～150ms/cm。
7.如权利要求1所述的控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法，其特征在于，所述步骤s4中的冲洗阶段，当裂解液的重均分子量在4000～5000范围内时，淋洗液的电导率为50～60ms/cm，所述淋洗液中淋洗液b的体积为40～45％；当裂解液的重均分子量在5000～6000范围内时，淋洗液的电导率为40～50ms/cm，所述淋洗液中淋洗液b的体积为35～40％；当裂解液的重均分子量在6000～7000范围内时，淋洗液的电导率为30～40ms/cm，所述淋洗液中淋洗液b的体积为30～35％。
8.如权利要求1所述的控制达肝素钠重均分子量及分子量分布的方法，其特征在于，所述步骤s5中的洗脱阶段，当裂解液的重均分子量在4000～5000范围内时，淋洗液的电导率为110～125ms/cm，所述淋洗液中淋洗液b的体积为90～100％；当裂解液的重均分子量在5000～6000范围内时，淋洗液的电导率为95～110ms/cm，所述淋洗液中淋洗液b的体积为80～90％；当裂解液的重均分子量在6000～7000范围内时，淋洗液的电导率为80～95ms/cm，所述淋洗液中淋洗液b的体积为70～80％。
