本发明属于生物医学检测，具体涉及一种3-羟基马尿酸衍生物、3-羟基马尿酸免疫检测试剂及其制备方法。
背景技术：
1、孤独症谱系障碍(autism spectrum disorders，asd)是一种起病于婴幼儿时期的神经发育障碍性疾病，患病率呈逐年上升趋势，该病以社会沟通与交往障碍，局限的、重复的刻板行为，狭窄的兴趣或活动为核心症状。3-羟基马尿酸(3-hydroxyhippuric acid，3hha)是肠道中梭菌类代谢副产物与人体代谢产物结合产生的苯丙氨酸异常代谢产物—m-酪氨酸(3-羟苯丙氨酸)的代谢产物，分子式为c9h9no4，分子量为195.17。能产生3hha的梭菌包括生孢梭菌、肉毒杆菌、耐热芽孢杆菌、芒氏梭菌、戈氏梭菌、双酶杆菌、艰难梭菌和索氏芽孢杆菌。临床上，尿液3-羟基马尿酸含量的检测具有重要的临床意义。高浓度的3-羟基马尿酸通过抑制多巴胺-β羟化酶，导致神经递质平衡紊乱，发生行为障碍和精神性问题，包括：抽搐、抑郁、自闭症、精神分裂症、攻击性、癫痫、厌食症及强迫症。自闭症谱系障碍(autism spectrum disorders，asds)患者的尿液中3hha含量明显升高，因此检测尿液中3hha的含量，有助于早期发现asds患者，及早进行行为干预和教育，改善asds患儿的不良预后情况。
2、检测3-羟基马尿酸的实验室方法有比色法、放射免疫分析法、高效液相色谱法、液相串联质谱法、酶联免疫吸附测定法等。比色法检测的是3-羟基马尿酸等类似物质的总量而非单一化合物的水平；放射免疫分析法稳定性较差，且存在放射线辐射与污染等问题；高效液相色谱法前处理复杂，要求目标分析物在色谱上被完全分离，因此分析时间较长；液相串联质谱法检测灵敏度高，快速快，但结构复杂，维护成本高，需经过专门培训的技术人员操作，不易在基层医疗机构普及；酶联免疫吸附测定法灵敏度高，特异性好，但检测时间长，准确度差，难以用于批量检测。因此，目前市面上缺乏线性范围宽、灵敏度高、准确度高、精密度高，检测时间短，样品处理简单，仪器自动化程度高，可多样本连续检测的3-羟基马尿酸检测产品。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是：提供一种3-羟基马尿酸衍生物、3-羟基马尿酸免疫检测试剂及其制备方法，实现3-羟基马尿酸的高通量、快速化检测。
2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一、提供一种3-羟基马尿酸衍生物，其结构式如下述式(ⅰ)所示：
4、
5、二、提供一种上述的3-羟基马尿酸衍生物的制备方法，所述制备方法的合成路线如下：
6、
7、具体的制备步骤如下：
8、a.化合物2的合成
9、
10、将3-羟基苯甲酸(13.8g，0.1mol)溶解于氢氧化钠(8g，0.2mol)水溶液(50ml)中，然后在0°-5°下冷却搅拌，同时逐滴加入氯甲酸乙酯(21.6g，0.2mol)，得到反应混合物溶液；滴加完成后，将所述反应混合物溶液加热至室温(20-25℃)，然后搅拌2小时。反应结束后，将所述反应混合物溶液用硫酸(35.6g，0.2mol)进行酸化；然后将分离出来的白色固体物质用纯化水洗涤；将得到的固体物质溶解于氯仿中，然后将此溶液通过mgso4进行干燥，并蒸发得到化合物2。
11、b.化合物3的合成
12、
13、将化合物2(2.1g，0.01mol)溶解于20ml dcm中，然后逐滴加入草酰二氯(2.5g，0.02mol)，然后在室温(20-25℃)条件下搅拌5小时；然后将此溶液在减压条件下蒸馏，并进行真空干燥；将所得剩余物溶解于20ml thf中，然后在20ml thf溶液中加入氨基乙酸(1.5g，0.02mol)，得到反应混合物溶液，将所述反应混合物溶液在室温(20-25℃)条件下搅拌4小时；反应结束后，在所述反应混合物溶液中加入浓度为5m的hcl，然后用氯仿萃取3次，纯化水洗涤，然后使用无水硫酸镁进行干燥，过滤、蒸馏，并进行真空干燥；所得剩余物用硅胶柱层析法进行纯化，得到化合物3。
14、c.化合物4的合成
15、
16、将化合物3(1.25g，0.005mol)溶解于100ml dcm中，然后逐滴加入hatu(1.9g，0.005mol)、tea(0.5g，0.005mol)、(2-氨基乙基)-氨基甲酸叔丁基酯(0.8g，0.005mol)，得到反应混合物溶液，然后将所述反应混合物溶液在室温(20-25℃)条件下搅拌12小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液在减压条件下蒸馏，并进行真空干燥；所得剩余物用硅胶柱层析法进行纯化，得到化合物4。
17、d.3-羟基马尿酸衍生物的合成
18、
19、将化合物4(1.2g，0.003mol)溶解于50ml meoh中，逐滴加入hcl/meoh(20ml，2m)，得到反应混合物溶液，然后将所述反应混合物溶液在室温(20-25℃)条件下搅拌12小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液在减压条件下蒸馏，并进行真空干燥；所得剩余物经制备级高效液相色谱(pre-hplc)纯化，得到3-羟基马尿酸衍生物(3-hydroxyhippuric acidderivative)。
20、三、提供一种3-羟基马尿酸免疫原，由上述的3-羟基马尿酸衍生物与甲基化的牛血清白蛋白连接而成，其结构式如下述式(ⅱ)所示：
21、
22、四、提供一种上述的3-羟基马尿酸免疫原的制备方法，包括以下步骤：
23、a.称取5.0-25.0mg上述式(ⅰ)所示的3-羟基马尿酸衍生物，溶解于5.0-25.0ml磷酸盐缓冲液(浓度为0.2mol/l、ph＝8.5)中，得到3-羟基马尿酸衍生物溶液；
24、b.称取10.0-50.0mg甲基化的牛血清白蛋白、1.0-10.0mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、50.0-100.0mg sulfo-nhs,溶解于1.0-5.0ml磷酸钾缓冲液(浓度为10.0mmol/l、ph＝4.5-5.0)中，然后在室温条件下搅拌反应5-25分钟，得到甲基化的牛血清白蛋白活性溶液；
25、c.将步骤b中得到的甲基化的牛血清白蛋白活性溶液直接倒入步骤a中得到的3-羟基马尿酸衍生物溶液中混匀，得到偶联反应混合溶液，然后将所述偶联反应混合溶液在室温条件下搅拌反应10-60分钟，搅拌结束后在2-8℃条件下静置12小时，得到3-羟基马尿酸免疫原溶液。
26、d.将步骤c中得到的3-羟基马尿酸免疫原溶液通过g-25葡聚糖凝胶层析柱纯化，纯化后得到3-羟基马尿酸免疫原，置于-20℃下储存。
27、五、提供一种抗3-羟基马尿酸特异性抗体，所述抗体是由上述的3-羟基马尿酸免疫原免疫实验动物后产生的多克隆抗体，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。
28、六、提供一种上述的抗3-羟基马尿酸特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
29、a.将上述式(ⅱ)所示的3-羟基马尿酸免疫原用pbs缓冲液稀释至2.0-5.0mg/ml，得到抗原溶液，然后将2.0-5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
30、b.1-4周后，再用2.0-5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔1-4周注射一次，共计注射3-8次；
31、c.对免疫后的实验动物取血，分离纯化抗血清，得到抗3-羟基马尿酸特异性抗体。
32、七、提供一种3-羟基马尿酸均相酶免疫检测试剂，包括r1试剂和r2试剂，所述r1试剂包含上述的抗3-羟基马尿酸特异性抗体和均相酶底物溶液，所述均相酶底物溶液由葡萄糖-6-磷酸和tris缓冲液配制而成；所述r2试剂包含上述的3-羟基马尿酸酶标偶联物和辅酶溶液，所述辅酶溶液由氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和tris缓冲液配制而成；使用时将所述r1试剂与r2试剂按1:1-4:1的体积比混合，优选按1:1的体积比使用。
33、所述3-羟基马尿酸酶标偶联物由上述的3-羟基马尿酸衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述式(ⅲ)所示：
34、
35、上述3-羟基马尿酸酶标偶联物的制备方法，包括以下步骤：
36、a.称取1.0-10.0mg上述式(ⅰ)所示的3-羟基马尿酸衍生物，溶解于0.1-1.0ml磷酸盐缓冲液(浓度为0.1mol/l、ph＝8.5)中，然后加入0.1-1.0ml无水dmf、1.0-20.0mg葡萄糖-6-磷酸搅拌均匀，得到3-羟基马尿酸衍生物溶液；
37、b.称取1.0-5.0mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)溶解于0.1-1.0ml磷酸盐缓冲液(浓度为10.0mmol/l、ph＝5.0-5.5)中，将溶液温度降至2～8℃，然后同时加入2.5-15.0mgsulfo-nhs与1.0-20.0mg edac，并在室温条件下缓慢搅拌反应1-5分钟，得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性溶液；
38、c.将步骤a制备的3-羟基马尿酸衍生物溶液与步骤b制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性溶液温度都降至2-8℃，然后将3-羟基马尿酸衍生物溶液逐滴添加到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性溶液中，整个滴加过程持续5分钟，随后将混合溶液在2-8℃下搅拌2小时，得到3-羟基马尿酸酶标偶联物溶液。
39、d.将步骤c制备的3-羟基马尿酸酶标偶联物溶液通过g-25葡聚糖凝胶层析柱(用50mm、ph＝9.0的tris缓冲液预平衡)纯化，纯化后添加质量分数0.5％的bsa及质量分数0.1％的nan3，得到3-羟基马尿酸酶标偶联物。
40、八、提供一种上述的3-羟基马尿酸均相酶免疫检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
41、a.r1试剂的制备：将2.5-7.5g的葡萄糖-6-磷酸用1.0-2.5l、55mmol/l、ph＝8.0的tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将上述的抗3-羟基马尿酸特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中，搅拌均匀得到r1试剂，所述抗3-羟基马尿酸特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:100-1:10000；优选地，所述抗3-羟基马尿酸特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1:1200；
42、b.r2试剂的制备：将5.0-15.0g的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸用2.0-5.0l、120mmol/l、ph＝8.2的tris缓冲液溶解制成辅酶溶液；再将上述的3-羟基马尿酸酶标偶联物加入所述辅酶溶液中，搅拌均匀得到r2试剂，所述3-羟基马尿酸酶标偶联物与辅酶溶液的体积比为1:100～1:10000；优选地，所述3-羟基马尿酸酶标偶联物与辅酶溶液的体积比为1:1800。
43、九、提供一种3-羟基马尿酸胶乳增强免疫比浊检测试剂，由l1试剂与l2试剂组成；
44、其中，所述l1试剂由上述的抗3-羟基马尿酸特异性抗体、ph＝8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸、促凝剂以及防腐剂组成；
45、所述l2试剂由3-羟基马尿酸-牛血清白蛋白复合体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒、ph＝8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸以及防腐剂组成；
46、所述的3-羟基马尿酸-牛血清白蛋白复合体由上述的3-羟基马尿酸衍生物与牛血清白蛋白偶联而成，其结构式如式(ⅳ)所示：
47、
48、所述的聚苯乙烯胶乳颗粒直径范围为50-250nm；
49、所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、mes缓冲液、硼酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液或巴比妥缓冲液中的一种；
50、所述促凝剂为peg-4000、peg-6000、peg-8000或硫酸葡聚糖钠中的一种；
51、所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、苯酚或乙基汞硫代硫酸钠中的一种。
52、十、提供一种上述的3-羟基马尿酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，包含以下步骤：
53、a.将0.5mg/ml上述的抗3-羟基马尿酸特异性抗体溶解于50mmol/l ph＝8.0的磷酸盐缓冲液中，然后添加质量分数为0.5％-2.5％的牛血清白蛋白、0.25％-1.0％的氯化钠、0.1％-0.5％的吐温-20、1.0％-5.0％的丙三醇、0.1％-1.0％的乙二胺四乙酸、0.5％-2.5％的peg-4000以及0.01％-0.1％的叠氮钠，搅拌均匀，调节ph＝7.5，制成l1试剂；
54、b.将0.5mg表面带有羧基的直径为150nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入4.5ml0.05mol/l ph＝6.2的mes缓冲液中，然后加入5mg碳二亚胺，在37℃下反应1小时，制成胶乳颗粒溶液，再将0.5mg 3-羟基马尿酸-牛血清白蛋白复合体用4.5ml0.05mol/l ph＝9.2的硼酸盐缓冲液稀释后，立即加入到上述胶乳颗粒溶液中，在37℃下反应12小时，然后加入1ml0.1mol/l ph＝8.5的甘氨酸缓冲液搅拌2小时，反应终止后离心去除上清液，再将沉淀物用10ml 50mmol/l ph＝8.0的tris-hcl缓冲液洗涤3次，再用25ml 50mmol/l ph＝8.5的甘氨酸缓冲液稀释成胶乳悬浊液，最后加入质量分数为0.5％-2.5％的牛血清白蛋白、0.25％-1.0％的氯化钠、0.1％-0.5％的吐温-20、1.0％-5.0％的丙三醇、0.1％-1.0％的乙二胺四乙酸以及0.01％-0.1％的叠氮钠，搅拌均匀，制成l2试剂；
55、所述的3-羟基马尿酸-牛血清白蛋白复合体的制备方法，包含以下步骤：
56、将10mg牛血清白蛋白用5ml 0.1mol/l ph＝7.8的磷酸盐缓冲液稀释，然后加入100mg上述结构式(ⅰ)所示的3-羟基马尿酸衍生物，再加入50mg的偶联活化剂，在4℃下反应12小时，再用0.1mol/l ph＝7.8的磷酸盐缓冲液在4℃下透析18小时，得到3-羟基马尿酸-牛血清白蛋白复合体；
57、所述的偶联活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、n，n′-二环己基碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺、三丁胺、戊二醛、二异氰酸化合物或二卤化二硝基苯中的一种。
58、本发明的有益效果是：获得了一种全新的3-羟基马尿酸衍生物，所述3-羟基马尿酸衍生物可以通过末端-nh2基团与载体蛋白中的游离-cooh偶联，使用所述3-羟基马尿酸衍生物制备出免疫原性强的3-羟基马尿酸免疫原，从而免疫实验动物得到高效价的抗3-羟基马尿酸特异性抗体；同时，所述3-羟基马尿酸衍生物可以通过末端-nh2基团与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶中的游离-cooh偶联，使用所述3-羟基马尿酸衍生物制备得到3-羟基马尿酸酶标偶联物。所述3-羟基马尿酸衍生物可以通过末端-nh2基团与牛血清白蛋白中的游离-cooh偶联，使用所述3-羟基马尿酸衍生物制备得到3-羟基马尿酸-牛血清白蛋白复合体。利用所述抗体与所述酶标偶联物制备得到3-羟基马尿酸均相酶免疫检测试剂；利用所述抗体与所述3-羟基马尿酸-牛血清白蛋白复合体制备得到3-羟基马尿酸胶乳增强免疫比浊检测试剂。本发明的两种3-羟基马尿酸免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对3-羟基马尿酸高通量、快速化的检测，同时具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低3-羟基马尿酸检测成本，有利于临床推广使用。
59、本发明另外一个有益效果在于：均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了防止葡萄糖-6-磷酸脱氢-半抗原酶标偶联物与酶的底物(葡萄糖-6-磷酸)及辅酶(氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)发生反应，必须将酶标偶联物与底物分开放置，不能混合。所以传统的均相酶免疫检测试剂是将底物、辅酶与半抗原特异性抗体混合在一起制成r1试剂，而将葡萄糖-6-磷酸脱氢-半抗原酶标偶联物单独加入r2试剂中的。也就是说，传统的均相酶免疫检测试剂在使用前底物与辅酶是混合在一起的。然而，如果在使用前操作者不慎将少量r2试剂混入r1试剂中，或者全自动生化分析仪运行过程中存在携带污染情况，就会使酶和底物提前发生反应，而且在底物和辅酶充足的情况下，反应会持续进行，导致底物被大量消耗，同时氧化态的辅酶会被大量还原成还原态的辅酶，从而导致检测试剂本底信号持续升高，严重影响检测结果的准确度，甚至导致试剂完全报废。本发明改进了传统均相酶免疫试剂的配方，将辅酶添加到r2试剂中，而r1试剂中只添加抗体与底物，不再添加辅酶，这样即使使用前有少量r2试剂混入r1试剂中，反应也会在辅酶消耗完后立刻终止。因此本发明可以有效避免试剂使用前r1试剂与r2试剂发生交叉污染导致的本底反应信号升高，避免了试剂浪费，提高了检测准确度。
1.一种3-羟基马尿酸衍生物，其特征在于，其结构式如下述式(ⅰ)所示：
2.一种如权利要求1所述的3-羟基马尿酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法的合成路线如下：
3.一种3-羟基马尿酸免疫原，其特征在于，由权利要求1所述的3-羟基马尿酸衍生物与甲基化的牛血清白蛋白连接而成，其结构式如下述式(ⅱ)所示：
4.一种如权利要求3所述的3-羟基马尿酸免疫原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.一种抗3-羟基马尿酸特异性抗体，其特征在于，所述抗体是由权利要求3所述的3-羟基马尿酸免疫原免疫实验动物后产生的多克隆抗体，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。
6.一种如权利要求5所述的抗3-羟基马尿酸特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.一种3-羟基马尿酸均相酶免疫检测试剂，其特征在于，包括r1试剂和r2试剂，所述r1试剂包含权利要求5所述的抗3-羟基马尿酸特异性抗体和均相酶底物溶液，所述均相酶底物溶液由葡萄糖-6-磷酸和tris缓冲液配制而成；所述r2试剂包含3-羟基马尿酸酶标偶联物和辅酶溶液；
8.一种如权利要求7所述的3-羟基马尿酸均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.一种3-羟基马尿酸胶乳增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，由l1试剂与l2试剂组成；
10.一种如权利要求9所述的3-羟基马尿酸胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
