背景技术：
1、人乳是碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和微量元素的复杂混合物。碳水化合物级分是最丰富的固体级分，且其可进一步分为乳糖和更复杂的寡糖，即所谓的人乳寡糖(hmo)。
2、虽然乳糖被用作能量来源，但是复杂的寡糖不会被婴儿或成人代谢。复杂寡糖的级分占总碳水化合物级分的最高达10％，并且可能由超过150种不同的寡糖组成。这些复杂寡糖的存在和浓度是人类所特有的，因此不会大量地存在于其他哺乳动物(例如驯养的产奶动物)的乳汁中。尽管hmo仅占人乳总量的一小部分，但是在过去几十年中，其对母乳喂养的婴儿的发育所具有的非常有益的影响变得日益明显。
3、最重要的hmo是2’-岩藻糖基乳糖。其他重要的hmo是3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳-n-四糖、乳-n-新四糖和乳-n-岩藻戊糖。除了这些中性寡糖之外，酸性hmo也存在于人乳中，酸性hmo包括3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖和唾液酸乳糖-n-四糖(例如lst-a、lst-b和lst-c(表1))。由于hmo存在至少一个唾液酸部分，因此人乳中最高达20％的总hmo含量是酸性的。这些结构与上皮细胞表面糖缀合物的抗原决定部位(lewis组织血型抗原)是密切相关的，并且hmo和上皮抗原决定部位之间的结构同源性解释了hmo抵御细菌病原体的能力(weichert等人2013年,nutr.res.33:831；weichert等人2016年,j.virol.90:4843)。
4、人乳中存在复杂的寡糖早已为人所知，几十年来，hmo的生理功能一直是医学研究的主题(gura 2014年,science 345:747；kunz&egge 2017年,in mcguire,mcguire&bode(编辑)prebiotics and probiotics in human milk,elsevier,london,第3-16页)。对于一些更丰富的hmo，已经确定了特定的功能(bode 2012年,glycobiology 22:147；bode&jantscher-krenn 2012年,adv.nutr.3s:383；morrow等人2004年,j.pediatr.145:297)。由于hmo在抑制传染性物质(细菌、病毒和细菌毒素)方面的生理能力、其在大脑发育方面产生的积极影响及其具有的益生元功能，因此非常需要在食品中，尤其是婴儿营养产品中包括hmo。表1提供了可通过本文公开的方法从发酵液中纯化出的hmo的概览。
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7、表1：可通过本文公开的方法纯化的人乳寡糖的列表。
8、单个hmo的有限供应并且没有找寻到能够获得足够数量的这些分子的资源促进了以生成它们的化学合成为基础的工艺的发展。然而，hmo的化学合成，尤其是大规模生产应用于食品中的足够质量的hmo，已被证明是极具挑战性的。特别地，hmo的化学合成如2’-fl(wo 2010/115935a)需要几种有害化学品，这可能会污染最终产品。
9、化学合成的缺陷促进了几种基于酶促和发酵的方法的发展(miyazaki等人2010年,methods enzymol.480:511；murata等人1999年,glycoconj.j.16:189；baumgartner等人2013年,microb.cell fact.12:40；lee等人2012年,microb.cell fact.1:48；albermann等人2001年,carbohydr.res.334:97；us 7,521,212 b1；fierfort&samain2008年,j.biotechnol.134:216)。然而，这些方法产生了寡糖的复杂混合物，因此所需的产物被原材料(如乳糖)以及中间体、不需要的副产物(例如源自某些糖基转移酶的副活性的副产物)和来自发酵方法的底物(如蛋白质、多肽、有机酸和盐)污染。
10、目前从混合物中纯化单个寡糖的许多方法在技术上很复杂，难以扩大规模，而且对于食品应用来说是不经济的。现已开发出工业规模工艺用于分别从乳清和糖蜜中纯化二糖乳糖和蔗糖，但这些方法包括多个复杂且以低产率获得产品的结晶步骤。然而，乳清和糖蜜是以“食品级”产品使用，远不及含有重组细菌或酵母的发酵液那么复杂和苛刻(就监管要求而言)。凝胶过滤色谱法是纯化复杂的寡糖(如通过微生物发酵生产的hmo)的最佳方法，但这种方法的缺点包括缺乏可放大性且不适合连续加工。因此凝胶过滤色谱法是不经济的，不能用于工业规模化生产hmo。
11、理论上，凝胶过滤色谱法是纯化复杂的寡糖(如通过微生物发酵生产的hmo)的最佳方法，但凝胶过滤色谱法的缺点包括缺乏可放大性和不适合连续加工。因此凝胶过滤色谱法是不经济的，不能用于工业规模化生产hmo。
12、在开发出通过微生物发酵生产hmo的有效方法和工艺之后，下一个合乎逻辑的步骤是开发有效的下游工艺以从培养液中分离hmo。
13、wo2015/049331a公开了一种纯化中性hmo的工艺。该工艺采用离子交换、电渗析和模拟移动床(smb)色谱法，以实现对大量hmo的连续和高效纯化。与用于生产中性hmo的化学合成路线及其后续纯化不同，所记载的发酵和纯化方法允许提供不含有害化学品(例如痕量重金属和有机溶剂)的hmo。该纯化方法得到了固体形式(通过喷雾干燥)或作为浓缩糖浆的高度纯化的hmo产品，这可以用于食品应用中。
14、wo 2015/106943 a记载了一种用于纯化通过微生物发酵产生的中性hmo的简单工艺。该工艺使用阳离子交换、阴离子交换和纳滤和/或电渗析的组合方法，其可有效纯化大量中性hmo。与早期的用于将微生物发酵产生的中性hmo进行纯化的方法不同，该工艺不包括色谱分离步骤。该工艺产生固体形式的hmo，为喷雾干燥材料、结晶材料或过滤除菌浓缩物。所得的hmo不包含蛋白质和用于生产的重组微生物菌株所产生的材料，因此是食品、医疗食品和饲料(例如宠物食品)应用的理想选择。
15、wo 2016/095924 a记载了一种通过结晶纯化2’-fl的方法。hmo由微生物发酵产生，除去生物质后，通过纳滤和电渗析对其进行浓缩。最后，使用乙酸从还含有2’,3-二-o-岩藻糖基乳糖(dfl)的水溶液中选择性结晶2’-fl。
16、lnt和lnnt可通过与活性炭选择性结合而与碳水化合物副产物分离，然后用有机溶剂洗脱并通过凝胶过滤色谱法进行分离(priem等人2002年,glycobiology 12:235；gebus等人2012年,carbohydr.res.361:83；baumgartner等人2014年,chembiochem 15:1896)。如上所述，凝胶过滤色谱法是一种方便的实验室规模方法，但其不能有效地按比例放大用于工业生产中。
17、wo 2015/049331 a公开了，将通过细菌发酵产生的lnt进行纯化以提供澄清、无颗粒的溶液的操作顺序如下：电渗析、纳滤、使用强阳离子交换树脂的模拟移动床(smb)色谱法、电渗析、超滤和第二个smb色谱法。
18、还记载了用于分离酸性hmo，尤其是唾液酸化乳糖或唾液酸化寡糖的各种方法。
19、us2007/0020736 a公开了3’-sl的制备，其中二唾液酸化和三唾液酸化的乳糖作为细菌大肠杆菌(escherichia coli)的遗传修饰菌株的副产物。3’-sl在培养液中积累至～0.8mm的浓度。使用以下步骤纯化3’-sl：离心，将上清液流经炭进行吸附并用蒸馏水洗掉水溶性盐，用含水乙醇梯度洗脱，最后在biogel柱上分离并脱盐。从1l培养液得到49mg 3’-sl。
20、另一种公开的方法包括使用遗传修饰的大肠杆菌(e.coli)菌株制备3’-sl，且随后通过细胞的热透化(heat permeabilization)以及之后的离心进行分离(priem等人2002年,glycobiology 12:235)。使上清液中的物质吸附到炭上，并用蒸馏水洗掉水溶性盐。在用含水的乙醇梯度洗脱后，3’-sl被吸附到hco3-(碳酸氢根离子)形式的强阴离子交换剂上，并用碳酸氢钠(nahco3)的线性梯度洗脱。后者通过阳离子交换(使用酸性形式的树脂)除去，导致49％的3’-sl回收效率。
21、另一以发酵液开始的过程包含热透化、离心、通过添加酸性形式的强阳离子交换树脂将ph值调节至3.0以及通过离心除去沉淀的蛋白质的步骤(fierfort等人2008年,j.biotechnol.134:261)。然后通过添加碱性形式的弱阴离子交换剂将上清液的ph值调节至6.0，并且使3’-sl键合至hco3-形式的阴离子交换剂。用蒸馏水洗涤，然后用nahco3连续梯度洗脱后，通过阳离子交换(使用酸性形式的树脂)除去nahco3，直到ph值降至3.0。最后，用naoh将ph值调至6.0。这种纯化策略实现了59％的3’-sl回收效率。
22、酶促产生的3’-sl也已通过纳滤与乳糖分离(nordvang等人2014年,separ.purif.technol.138:77)。作者表明，两种不同的纳滤膜可在渗滤(diafiltration)后将大部分3’-sl从乳糖中分离出来，这两种不同的纳滤膜其中一种具有600-800da的截留分子量(mwco)(磺化聚醚砜(spes)膜)，另一种具有1000-1400da的截留分子量(mwco)(spes膜)。然而，在该工艺中3’-sl的损失显著且纯度低，需要额外的离子交换纯化步骤。
23、wo 2010/106320 a2记载了一种从乳清中富集3’-sl的方法。首先，通过超滤除去蛋白质，然后将澄清的乳清渗透液与离子交换树脂一起孵育以捕获3’-sl。从离子交换材料中洗脱后，通过纳滤浓缩富集的3’-sl部分，使浓缩物脱矿质。脱矿质后，将3’-sl浓缩并干燥，得到3’-sl含量为20重量％的最终干燥产品。
24、wo 2018/020473 a记载了一种从液体源中富集3’-sl和6’-sl的其他工艺。通过加热溶液、酶处理和额外的超滤和纳滤步骤，从乳糖结晶的母液中分离出这两种hmo。富集后，3’-sl和6’-sl的含量为10-30重量％(干质量)。
25、从现有技术出发，本发明的目的是提供一种用于纯化由微生物发酵生产的目标寡糖，特别是中性hmo或唾液酸化hmo的方法，其中所述工艺易于放大生产并适用于商业化或工业化规模来制造所述目标寡糖，并且这可产生具有使产品适合人类食用的纯度的产品。
26、必须强调的是，微生物发酵液，特别是含有重组微生物(细菌或真核微生物，如巴氏酵母)的发酵液比乳源产品流复杂得多。例如，乳清的组成为～94％的水、4-5％的乳糖、0.5-1％的蛋白质和仅有的很少的已经确定的矿物质(如钙、钾和磷)，还有一些维生素，仅在乳品流中浓缩和脱矿质的简单的基质。相比之下，从重组微生物发酵工艺中获得的糖溶液的基质非常复杂，首先是根据政府规定，按照法律要求分离重组生物质并使其失活。获得的澄清肉汤(broth)是包含不同盐类和离子的不确定基质，还含有重金属和微量元素。此外，此类液体的挑战是除去细胞碎片、膜碎片如脂类、蛋白质、源自微生物细胞代谢的分子且尤其是dna。因此，与乳清和乳品流相比，通过重组加工助剂(如基因修饰细菌)生产的寡糖的回收更具挑战性，因为肉汤内的污染物在分子量、带电分子(单电荷和多电荷)和着色分子方面差异性都非常高。
技术实现思路
1、本发明提供了一种由通过使用重组发酵菌株的微生物发酵而获得的培养液或发酵液中，将通过发酵生产的目标寡糖，以分批方式或以连续方式进行纯化的方法。先前描述的纯化策略通常采用昂贵的离子交换步骤(需要阳离子和阴离子交换剂)。离子交换剂不能连续使用，因为它们需要再生。培养液含有目标寡糖、生物质、培养基成分、盐和污染物如其他酸和色素。
2、在纯化工艺中，培养液可以进行以下的纯化步骤来获得目标寡糖：
3、1)通过微滤从培养液中分离微生物细胞
4、2)通过超滤从澄清的培养液(＝工艺流)中分离蛋白质
5、3)第一个纳滤步骤除去肽和高分子量(hmw)杂质
6、4)第二个纳滤步骤除去水和盐
7、5)活性炭处理除去色素和其他杂质
8、6)使用纳滤膜的电渗析或渗滤以完全除去污染盐
9、7)通过反渗透除去水
10、此外，可在活性炭处理之前引入另一个电渗析步骤，以减少污染离子的量。为了在水溶液中纯化后，得到固体形式的目标寡糖，可将材料喷雾干燥或造粒。
1.一种喷雾干燥的粉末，其中，所述喷雾干燥的粉末含有目标寡糖，所述目标寡糖是固体颗粒形式。
2.根据权利要求1所述的喷雾干燥的粉末，其中，所述目标寡糖的粒径为5-500微米。
3.根据权利要求1所述的喷雾干燥的粉末，其中，所述目标寡糖的粒径为10-300微米。
4.根据权利要求1所述的喷雾干燥的粉末，其中，所述目标寡糖的平均粒径为10-100微米，优选为20-90微米，更优选为30-80微米，最优选为40-70微米。
5.根据权利要求1所述的喷雾干燥的粉末，其中，所述目标寡糖是无定形状态。
6.根据权利要求1所述的喷雾干燥的粉末，其中，所述目标寡糖是无结晶物质特征峰的无定形状态。
7.根据权利要求1所述的喷雾干燥的粉末，其中，所述目标寡糖包含≤10重量％的水，优选包含≤8重量％的水，更优选包含≤5重量％的水。
8.根据权利要求1所述的喷雾干燥的粉末，其中，所述目标寡糖的玻璃化转变温度为60-90℃，优选为62-88℃，更优选为64-86℃。
9.根据权利要求1所述的喷雾干燥的粉末，其中，所述目标寡糖为中性寡糖或唾液酸化寡糖，优选为中性hmo或唾液酸化hmo，更优选为2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’，3-二岩藻糖基乳糖、乳-n-三糖ii、乳-n-四糖、乳-n-新四糖、乳-n-岩藻戊糖i、乳-n-新岩藻戊糖、乳-n-岩藻戊糖ii、乳-n-岩藻戊糖iii、乳-n-岩藻戊糖v、乳-n-新岩藻戊糖v，乳-n-二岩藻己糖i、乳-n-二岩藻己糖ii、6’-半乳糖基乳糖、3’-半乳糖基乳糖、乳-n-己糖和乳-n-新己糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、唾液酸乳糖-n-四糖a、唾液酸乳糖-n-四糖、唾液酸乳糖-n-四糖c、3-岩藻糖基-唾液酸乳糖、二唾液酸-乳-n-四糖和岩藻糖基-lst b。
10.根据权利要求1所述的喷雾干燥的粉末，其中，所述喷雾干燥的粉末不含内毒素。
