本申请涉及基于酶肽自组装的生物探针及其在检测ota中的应用，属于分析检测。
背景技术：
1、赭曲霉毒素a(ota)是由多种生长在粮食(如小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等)和蔬菜(豆类)等农作物上的曲霉和青霉产生的。已发现有7种曲霉和6种青霉菌能产生ota，但主要由纯绿青霉、赭曲霉和碳黑曲霉产生。赭曲霉毒素a是一种无色结晶化合物，可溶于极性有机溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水。其苯溶剂化物熔点94～96℃，二甲苯中结晶熔点169℃。有光学活性[α]d-118°。其紫外吸收光谱随ph值和溶剂极性不同而有别，在乙醇溶液中最大吸收波长为213nm和332nm。有很高的化学稳定性和热稳定性。
2、ota主要侵害动物肝脏与肾脏，这种毒素主要是引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死，还在动物试验中观察到它的致畸作用。目前对于ota的快速检测方法主要是利用特异性的生物识别受体，例如抗体和适配体，对应开发的酶联免疫吸附法、适配体化学发光法等。但是对于免疫原性较低的ota小分子，抗体的筛选周期较长并且操作复杂；适配体虽然能够对任意靶标的小分子进行筛选，但是ota有一定毒性，适配体对于毒性小分子表达失败几率较高。肽作为与蛋白质有相同组成单体的结构单元，具有单体丰富(20种氨基酸)、生物相容性好、高活性的优点，因此有望成为下一代高效的小分子识别受体。然而肽在与小分子结合时不能直接产生可测量的信号，这阻碍了它们进一步转化为识别或生物受体工具。
技术实现思路
1、针对上述现有技术的不足，本发明提供了基于酶肽自组装的探针增强化学发光的方法及其在检测ota中的应用，目的在于解决目前筛选出的特异性结合肽与小分子ota结合时不能直接产生可测量的信号，进而使活性肽作为识别或生物受体工具应用于ota检测受到了限制的技术问题。
2、本发明提供的第一个技术方案为基于酶肽自组装的生物探针的制备方法，包括如下步骤：
3、s1，将特异性结合肽特异性结合肽与辣根过氧化酶在缓冲液中进行混合，获得酶肽溶液；
4、s2，向步骤s1的酶肽溶液中加入cacl2水溶液，获得纳米花制备初始混合溶液；
5、s3，将步骤s2中的初始混合溶液于室温下静置进行自组装反应；
6、s4，步骤s3中的自组装反应结束后进行离心，收集沉淀，并对沉淀进行清洗，直至洗净游离的辣根过氧化酶，获得肽纳米花(peptide nanoflower，pnf)材料，即基于酶肽自组装的生物探针。
7、在某些实施方式中，步骤s1中，所述特异性结合肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。
8、在某些实施方式中，步骤s1中，在特异性结合肽与辣根过氧化酶的混合体系中，所述特异性结合肽的添加量为0.2～0.5mg/ml，所述辣根过氧化酶的添加量为10～50mg/l。
9、在某些实施方式中，步骤s1中，所述缓冲液为5mmol/l，ph 7.4的pbs溶液。
10、在某些实施方式中，步骤s2中，在酶肽溶液和cacl2水溶液的混合体系中，所述cacl2的添加量为2～5mmol/l。
11、在某些实施方式中，步骤s3中，静置的时间不低于12h。
12、在某些实施方式中，步骤s4中，所述离心的转速为不低于11000rpm，离心的时间不少于5min。
13、在某些实施方式中，步骤s4中，所述清洗的方式如下：加水重悬重复洗涤。
14、在某些实施方式中，还包括步骤s5，对步骤s4中的肽纳米花置于-80℃冰箱速冻半小时，再放入冷冻干燥机干燥24小时，得到白色粉末状固体材料。
15、本发明提供的第二个技术方案为利用第一个技术方案所述方法制备的基于酶肽自组装的生物探针。
16、本发明提供的第三个技术方案为一种检测ota的方法，所述方法为将第二个技术方案所述的生物探针水溶液与待检测样液混合后，再加入鲁米诺氢氧化钠溶液和h2o2水溶液组成反应体系进行发光反应，通过所述发光反应的化学发光强度来表征待检测样液中的ota的含量。其中，待检测样液来自于谷物、酒类或谷物制备的调味品。
17、在某些实施方式中，所述反应体系中，所述生物探针水溶液的浓度为1mg/ml，所述生物探针水溶液的添加量为40～90μl；所述鲁米诺氢氧化钠溶液的ph为12.0～13.0，所述鲁米诺氢氧化钠溶液的浓度为0.5～10mmol/l；所述h2o2水溶液的浓度为5～20mmol/l。
18、在某些实施方式中，所述发光反应的时间为2～4min。
19、在某些实施例中，利用反应体系的不同浓度的ota与所述反应体系的化学发光强度建立线性方程，通过所述线性方程计算待检测样液中的ota的含量。
20、进一步，所述线性方程建立的方法如下：
21、(1)白色酶标板中加入60μl的1mg/ml生物探针水溶液，然后分别加入50μl 10、25、50、100、150、200、250ng/ml不同浓度的ota，静置反应2min后，加入ph为12.5的5mmol/l鲁米诺氢氧化钠溶液和15mmol/l的h2o2水溶液反应3min；
22、(2)反应结束后利用酶标仪检测化学发光强度；
23、(3)以ota浓度为横坐标，步骤(2)中的化学发光强度为纵坐标，构建回归曲线，拟合获得线性回归方程。
24、本发明提供的第四个技术方案为第一个技术方案所述的方法、第二个技术方案所述的生物探针或者第三个技术方案所述的方法在食品领域的应用。
25、相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：本发明提供了一种新的自组装杂化纳米材料肽纳米花(pnf)作为生物探针，将能够辅助转化和放大结合信号的hrp酶和特异性识别ota的肽结合，它能够在不需要化学修饰或偶联反应的情况下特异性识别ota并产生信号。基于该材料，提供了一种增强化学发光(cl)生物测定ota的方法，上述方法具有快速、简单和高灵敏度的性能，检测限低至0.08ng/ml，检测范围宽至0.1ng/ml至250ng/ml。基于肽的快速检测方法为未来食品领域的生物检测带来了新的途径，本发明也为酶-肽自组装为特异性受体与小分子配体的直接结合产生可测量信号提供了新的思路，有望应用于更广阔的市场中。
1.一种基于酶肽自组装的生物探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述特异性结合肽的氨基酸序列如seq id no.1所示；在特异性结合肽与辣根过氧化酶的混合体系中，所述特异性结合肽的添加量为0.2～0.5mg/ml，所述辣根过氧化酶的添加量为10～50mg/l。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤s2中，在酶肽溶液和cacl2水溶液的混合体系中，所述cacl2的添加量为2～5mmol/l。
4.根据权利要求1～3所述的方法，其特征在于，步骤s3中，静置的时间不低于12h。
5.利用权利要求1～4所述的方法制备的基于酶肽自组装的生物探针。
6.一种检测ota的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求5所述的生物探针的水溶液与待检测样液混合后，再加入鲁米诺氢氧化钠溶液和h2o2水溶液组成反应体系进行发光反应，通过所述发光反应的化学发光强度来表征待检测样液中的ot a的含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，所述生物探针的水溶液的浓度为1mg/ml，所述生物探针的水溶液的添加量为40～90μl；所述鲁米诺氢氧化钠溶液的ph为12.0～13.0，所述鲁米诺氢氧化钠溶液的浓度为0.5～10mmol/l；所述h2o2水溶液的浓度为5～20mmol/l；所述发光反应的时间为2～4min。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用反应体系的不同浓度的ota与所述反应体系的化学发光强度建立线性方程，通过所述线性方程计算待检测样液中的ota的含量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述线性方程建立的方法如下：
10.权利要求1～4所述的方法、权利要求5所述的生物探针或者权利要求6～9所述的方法在食品领域的应用。
