本发明属于基因工程，尤其涉及一种用于提高crispr/cas9系统基因编辑效率的启动子、基因编辑载体与应用。
背景技术：
1、丹参(salvia miltiorrhiza)是一种高价值的中药，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈的功能。由于其基因组小、活性成分生物合成途径清晰、遗传转化技术成熟的特点，具有成为药用模式植物的潜力。在丹参育种的过程中，传统育种技术仍占据重要地位，但是育种周期长、效率低；人工诱变虽然提高了变异频率，但育种精度低，筛选难度大；杂交育种虽然能够弥补两者的不足，却也面临着远缘杂交不亲和的问题。
2、crispr-cas9基因编辑系统的建立有助于创造具有特定性状但不含有外源基因的种质资源，消除了转基因植物的生物安全忧虑。以基因编辑手段创制作物种质已被广泛认可，因此，将基因编辑技术应用到药用植物，特别是药用模式植物中，对揭示道地药材形成的分子机制及定向培育高产新品种具有重要意义。crispr-cas9基因编辑技术是通过人工设计的sgrna(guide rna)来识别目的基因、并引导cas9蛋白酶进行目的基因的切割，形成双链断裂，损伤后修复实现基因的敲除或插入。然而，在丹参的基因编辑过程中发现，启动cas9转录的启动子不同，编辑效率不同，植物常用的35s强启动子编辑效率较低，后期筛选基因编辑阳性植株的工作量很大，因此，寻求具有更高转录活性的启动子受到了本领域技术人员的持续关注。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于提高crispr/cas9系统基因编辑效率的启动子、基因编辑载体与应用，所述丹参smrps5a启动子对3个sgrna靶点的基因编辑效率均达到了91％以上，smef1α和smubi对sgrna3靶点的基因编辑效率也达到了87.50％以上，对后期筛选基因编辑阳性植株的工作提供了依据。
2、为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
3、本发明提供了丹参smrps5a、smef1α或smubi启动子在提高crispr/cas9基因编辑效率中的应用，所述丹参smrps5a启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述丹参smef1α启动子的核苷酸序列如seq idno.2所示，所述丹参smubi启动子的核苷酸序列如seq idno.3所示。
4、本发明还提供了用于扩增丹参smrps5a、smef1α或smubi启动子的引物组，扩增丹参smrps5a启动子的引物组如seq id no.4和seq id no.5所示，扩增smef1α启动子的引物组如seq id no.6和seq id no.7所示，扩增smubi启动子的引物组如seq id no.8和seq idno.9所示。
5、本发明还提供了一种用于提高crispr/cas9基因编辑效率的基因编辑载体，包括所述的丹参smrps5a、smef1α和smubi启动子中的一种。
6、优选的，还包括初始载体，初始载体上克隆有用于靶向目的基因的sgrna序列和能够编码cas9蛋白的核苷酸序列。
7、优选的，所述cas9蛋白的核苷酸序列如seq id no.10所示。
8、本发明还提供了所述的基因编辑载体的构建方法，包括如下步骤：
9、(1)将丹参smrps5a、smef1α或smubi启动子连接至plb载体上，pcr扩增，获得含有载体序列的prosmrps5a片段、prosmef1α片段或prosmubi片段；
10、(2)将prosmu6和smopr3-sgrna1-sgrna2-sgrna3串联靶点序列分别连接至plb载体上，pcr扩增，获得含有载体序列的prosmu6片段和smopr3-sgrna1-sgrna2-sgrna3串联靶点片段；
11、(3)用限制性内切酶pmei和kpni对基因编辑空载体进行双酶切，获得cas9-kan线性化编辑载体；
12、(4)将步骤(2)获得的含有载体序列的prosmu6片段和smopr3-sgrna1-sgrna2-sgrna3串联靶点片段、步骤(3)获得的cas9-kan线性化编辑载体与步骤(1)获得的含有载体序列的prosmrps5a片段进行同源重组，制备获得含有prosmu6-smopr3-sgrna1-sgrna2-sgrna3-prosmrps5a-cas9-kan的基因编辑载体；
13、或将步骤(2)获得的含有载体序列的prosmu6片段和smopr3-sgrna1-sgrna2-sgrna3串联靶点片段、步骤(3)获得的cas9-kan线性化编辑载体与步骤(1)获得的含有载体序列的prosmef1α片段进行同源重组，制备获得含有prosmu6-smopr3-sgrna1-sgrna2-sgrna3-prosmef1α-cas9-kan的基因编辑载体；
14、或将步骤(2)获得的含有载体序列的prosmu6片段和smopr3-sgrna1-sgrna2-sgrna3串联靶点片段、步骤(3)获得的cas9-kan线性化编辑载体与步骤(1)获得的含有载体序列的prosmubi片段进行同源重组，制备获得含有prosmu6-smopr3-sgrna1-sgrna2-sgrna3-prosmubi-cas9-kan的基因编辑载体。
15、优选的，步骤(1)所述pcr扩增含有smrps5a的载体的引物如seq idno.11和seq idno.12所示，所述pcr扩增含有smef1α的载体的引物如seq id no.13和seq id no.14所示，所述pcr扩增含有smubi的载体的引物如seq id no.15和seq id no.16所示。
16、优选的，步骤(2)所述pcr扩增含有prosmu6的载体的引物如seq idno.17和seq idno.18所示，所述pcr扩增含有smopr3-sgrna1-sgrna2-sgrna3串联靶点的载体的引物如seqid no.19和seq id no.20所示。
17、本发明还提供了所述的基因编辑载体在提高crispr/cas9系统基因编辑效率中的应用。
18、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
19、本发明提供的3种丹参smrps5a、smef1α、smubi启动子能够提高crispr/cas9基因编辑系统的编辑效率，驱动cas9的高效表达。基因编辑效率测试实验结果显示，35s启动子对3条sgrna靶点的编辑效率低至53.13％，而本发明提供的启动子smrps5a对3种sgrna靶点的基因编辑阳性率均达到91％以上，明显优于35s启动子的编辑效率；且启动子smubi与smef1α对部分sgrna靶点同样具有比35s启动子更高的编辑效率。
20、此外，本发明提供的3个丹参自身的启动子，不仅适用于敲除系统，同样适用于基因敲入，单碱基替，引导编辑等系统中cas9基因的启动子。对搭建丹参的突变株库及实现精准育种具有重要意义。同时，本发明提供的3个启动子还适用于与丹参近缘的鼠尾草属植物。
1.丹参smrps5a、smef1α或smubi启动子在提高crispr/cas9基因编辑效率中的应用，其特征在于，所述丹参smrps5a启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述丹参smef1α启动子的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述丹参smubi启动子的核苷酸序列如seq idno.3所示。
2.用于扩增丹参smrps5a、smef1α或smubi启动子的引物组，其特征在于，扩增丹参smrps5a启动子的引物组如seq id no.4和seq id no.5所示，扩增smef1α启动子的引物组如seq id no.6和seq id no.7所示，扩增smubi启动子的引物组如seq id no.8和seq idno.9所示。
3.一种用于提高crispr/cas9基因编辑效率的基因编辑载体，其特征在于，包括权利要求1所述的丹参smrps5a、smef1α和smubi启动子中的一种。
4.根据权利要求3所述的基因编辑载体，其特征在于，还包括初始载体，初始载体上克隆有用于靶向目的基因的sgrna序列和编码cas9蛋白的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的基因编辑载体，其特征在于，所述编码cas9蛋白的核苷酸序列如seq id no.10所示。
6.如权利要求3～5任一项所述的基因编辑载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述pcr扩增含有smrps5a的载体的引物如seq id no.11和seq id no.12所示，所述pcr扩增含有smef1α的载体的引物如seq id no.13和seq id no.14所示，所述pcr扩增含有smubi的载体的引物如seq idno.15和seq idno.16所示。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述pcr扩增含有prosmu6的载体的引物如seq id no.17和seq id no.18所示，所述pcr扩增含有smopr3-sgrna1-sgrna2-sgrna3串联靶点的载体的引物如seq id no.19和seq id no.20所示。
9.权利要求3～5任一项所述的基因编辑载体在提高crispr/cas9系统基因编辑效率中的应用。
