本技术涉及电化学生物传感器，尤其是涉及一种用于体内葡萄糖连续检测的生物传感试纸及制备方法。
背景技术：
1、葡萄糖、乳糖、氧等多种分析物的水平是反应人体健康的重要指标，其浓度水平的高或低可能会对人体产生不利影响。尤其对于糖尿病患者来说，葡萄糖水平的监测非常重要，因为他们必须知道什么时候需要使用胰岛素以降低体内的葡萄糖水平，避免高血糖导致的各种并发症，或者什么时候需要葡萄糖以升高他们体内的葡萄糖水平，避免低血糖发生。
2、目前，大多数糖尿病患者采用的体内监测血糖水平的常规技术为定期抽血，将血液加到测试带上，然后利用比色法、电化学方法或光度计检测来确定血糖水平。这种技术不能连续或者自动地监测体内血糖水平，而是需要定期地用手动操作方式进行。很多糖尿病患者发现定期测试很不方便，并且有时他们会忘记测试其血糖水平，或者没有时间进行适当的测试，会有隐匿性高血糖、低血糖出现。测试引起的出血和疼痛，也是导致患者血糖监测依从性较差的原因。这些情况也可能会导致不能及时发现高血糖或低血糖现象，并及时采取措施。因此，需要一种能够连续或自动地监测体内血糖水平的葡萄糖探测器，使患者更容易地监测其血糖或其它分析物，并进行连续检测，及时发现异常。
3、目前，已有多种装置用于连续或自动地监测血流或间质液中的分析物，如葡萄糖。多数这样的装置使用电化学探测器，它直接植入到病人的血管中或者皮下组织内。然而，这些装置经常难以大规模地再现性或价廉地生产。另外，这些装置一般较大、笨重，不灵活，并且很多不能在受控的医疗设施如医院或医生的办公室之外有效地利用，除非限制病人活动。一些装置包括探测器引导物，放置在病人的皮肤上或靠近皮肤的位置上，并且可以绑附在病人身上以将探测器固定在原位。这些探测器引导物一般也比较笨重，不能自由移动。另外，探测器引导物或探测器包括用于将探测器连接到其他设备以将信号从探测器传输到分析仪的电缆或电线。探测器引导物的体积和电缆和电线的存在限制了每天方便地使用这些装置。
4、在设计探测器时，探测器在植入的同时病人的舒适度和活动范围是重要的考虑因素。因此，需要一种小巧、便捷的装置，它可以连续地监测分析物，如血糖的水平，同时还允许病人能够有正常的活动。连续和/或自动地监测分析物的水平，可以在病人的分析物的水平处于或接近阈值时给病人发出警告，以便病人可以采取适当的措施。一代葡萄糖传感器，用酶促反应的产物过氧化氢，或者氧气为电子酶介。这种技术的传感器中氧浓度的变化值与葡萄糖呈线性关系，通过检测溶解氧气的下降值来测试葡萄糖的含量。但是该技术受氧气的影响比较大，氧气缺乏的时候，电流降低，影响灵敏度。二代葡萄糖传感器，利用人造电子介质来介质gox，不需要依靠氧气。人造电子介质可以是复在酶上，形成连线酶，或者是包埋在酶膜中的固定介质。但是介质经常有生物毒性，容易泄露，不利于包埋体内或者接触身体的葡萄糖检测用。
5、因此需要开发一种无人造电子介质、不受氧气影响以及没有电子介质的用于体内葡萄糖连续检测的生物传感器。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的不足，本技术提供一种用于体内葡萄糖连续检测的生物传感试纸，该生物传感试纸没有毒性，没有电子介质，产品稳定，且仅针对葡萄糖，具有非常专一的底物选择性，可以较好地应用在人体内血糖的连续检测中，应用前景良好。
2、为此，本技术第一方面提供了一种用于体内葡萄糖连续检测的生物传感试纸，所述生物传感试纸包括印刷有工作电极、参比电极和对电极的柔性电极网印片，且所述工作电极的反应区上修饰固定有电极酶膜，所述反应区设置于所述工作电极的顶端。
3、本技术所提供的生物传感试纸小巧、便捷，没有毒性，没有电子介质，产品稳定，将该生物传感试纸植入体内后，体液浸没三电极(工作电极、参比电极和对电极)顶端，导通电路进行检测，得到电流，转化为葡萄糖浓度信息，实现连续或自动地监测体内的血糖水平。
4、在一些实施方式中，所述柔性电极网印片包括一层柔性电极基底以及一组工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极、参比电极和对电极依次叠加印刷在所述柔性电极基底上，且每层电极上均设置有一层绝缘层。
5、本技术中，当所述柔性电极网印片中包括一组工作电极、参比电极和对电极时，所述生物传感试纸为单面的生物传感试纸。所述柔性电极网印片中的一组工作电极、参比电极和对电极通过层层印刷的方式，依次叠加在柔性电极基底上，每层电极上通过设置一层绝缘层将电极层隔开，防止电极层互相之间的接触，仅暴露出三电极的顶端，电极酶膜位于暴露出的工作电极的反应区，检测过程中电极酶膜中的酶能够与体内间质液中的葡萄糖进行反应，进而获得体内的血糖水平。
6、在一些实施方式中，所述柔性电极网印片包括一层柔性电极基底以及两组工作电极、参比电极和对电极，两组工作电极、参比电极和对电极以镜面对称的方式分别依次叠加印刷在柔性电极基底的两面，且每组中的每层电极上均设置有一层绝缘层。
7、本技术中，当所述柔性电极网印片中包括两组工作电极、参比电极和对电极时，所述生物传感试纸为双面的生物传感试纸。所述柔性电极网印片中的两组工作电极、参比电极和对电极以镜面对称的方式分别依次叠加印刷在柔性电极基底的两面，同样每组三电极的每层电极上通过设置一层绝缘层将电极层隔开，防止电极层互相之间的接触，仅暴露出三电极的顶端，电极酶膜位于暴露出的两个工作电极的反应区，植入人体后，体液浸没两面的三电极顶端，导通电路进行检测，得到电流，进行转化计算，取平均值得出葡萄糖浓度信息。
8、本技术中，所述柔性电极基底可以采用高分子聚酰胺绝缘基底。
9、在一些实施方式中，所述工作电极和对电极采用油墨进行印刷，所述油墨中包含20～30wt％的二氧化钛、0.1～1wt％的石墨烯、0.1～1wt％的碳纳米管、10～25wt％的羧酸、2～5wt％的有机溶剂和2～5wt％的表面活性剂。
10、本技术对工作电极和对电极印刷时采用的油墨进行了优化，油墨中添加的二氧化钛、石墨烯和碳纳米管具有多孔结构，将反应酶液印刷在工作电极的反应区时，油墨中具有多孔结构的二氧化钛、石墨烯和碳纳米管能够负载更多的酶，用于后续与葡萄糖反应，提高了检测结果的准确性和稳定性；油墨中添加的羧酸中的羧基能够与酶中的羟基进行酯化反应化学交联，使得反应区上酶的固定更加稳固，即使在没有电子介质的前提下，也可以是酶稳固地固定在反应区，降低了生物传感试纸的毒性，同时有助于提高检测结果的准确性；油墨中添加的有机溶剂用于分散羧酸，表面活性剂能使二氧化钛、石墨烯和碳纳米管更均匀地分散在油墨中。
11、本技术中，所述有机溶剂例如为四氢呋喃，所述表面活性剂例如为吐温-80，所述羧酸例如可以为甲酸、乙酸、丙酸等。所述油墨的配制方法可以为：将羧酸分散于有机溶剂中制得含羧酸的有机溶液；然后将所述含羧酸的有机溶液、二氧化钛、石墨烯、碳纳米管和表面活性剂添加在市售的油墨中搅拌均匀，制得所述油墨。本技术中采用的市售的油墨例如可以可以购自杜邦。
12、进一步地，本技术对油墨中的二氧化钛含量和羧酸含量进行了优化，发现将油墨中二氧化钛的含量控制在20～30wt％，尤其是25wt％时，检测结果具有更好的稳定性；将油墨中羧酸的含量控制在10～25wt％，尤其是20wt％时，有助于提高检测结果的稳定性。
13、在一些实施方式中，所述电极酶膜采用反应酶液进行印刷，所述反应酶液中包含1～5wt％的葡萄糖脱氢酶、1～5wt％的还原型辅酶ii、2～5wt％的粘结剂、0.5～1.5wt％的表面活性剂、0.5～1.5wt％的交联剂和2～5wt％的有机溶剂；其中所述葡萄糖脱氢酶和还原型辅酶ii均为经生物工程改造后添加有羟基基团的酶。
14、本技术中所述反应酶液中的葡萄糖脱氢酶和还原型辅酶ii用于与人体内间质液中的葡萄糖进行反应。本技术中所采用的葡萄糖脱氢酶和还原型辅酶ii均为经生物工程改造后添加有羟基基团的酶，通过在酶上添加羟基基团后，能够使酶上有更多的羟基与油墨中的羧酸中的羧基发生化学交联，进一步提高酶固定的稳固性，提升检测效果。本技术中对酶进行生物工程改造的过程为：采用大肠杆菌基因序列，在酶上添加含有比较多的羟基的基团。
15、需要注意的是，本技术所述反应酶液中的酶也可以为非生物工程改造的酶，也即直接采用购买的酶(如sigma公司)也能使用，但是采用生物工程改造后的酶能进一步提升检测效果。
16、本技术中酶反应液中的粘结剂例如可以为明胶，用于反应酶液的点胶成膜；所述交联剂例如可以为乙烯基硅烷，用于将酶固定于反应区；有机溶剂例如可以为四氢呋喃，用于交联剂的溶解；表面活性剂例如可以为吐温-80，用于酶的均匀分散。
17、本技术中，酶反应液可以采用基础缓冲液(如pbs缓冲液等)进行配制；具体配制方法可以为：将交联剂溶解于有机溶剂中，形成含交联剂的有机溶液；将所述含交联剂的有机溶液、葡萄糖脱氢酶、还原型辅酶ii(辅酶nadph)、粘结剂和表面活性剂加入到基础缓冲液中，搅拌至完全溶解，制得所述酶反应液。
18、在一些实施方式中，所述电极酶膜上还印刷有一层限制扩散膜；所述限制扩散膜通过高聚物溶液进行印刷，所述高聚物溶液中含有5～20wt％的高聚物。
19、本技术中通过在电极酶膜印刷一层限制扩散膜能使体液中的葡萄糖不能快速接触反应区中的酶，进而使反应更加平稳匀速地进行，能进一步扩大生物传感试纸对葡萄糖的检测范围。
20、本技术，所述高聚物例如可以为聚氨酯、聚硅氧烷、聚酰胺等。所述高聚物溶液可以采用亲水性基础缓冲液(如pbs缓冲液等)进行配制，也可以采用有机溶剂(如丙酮等)进行配制。
21、在一些实施方式中，所述生物传感试纸的工作电压为0.05～0.3v，葡萄糖的浓度检测范围为0～33.3mm。
22、本技术中，所述生物传感试纸的工作电压可以低至0.05v，工作电压低，能够有效排体内液内的干扰物质，检测过程无干扰，提高了检测结果的准确性。
23、本技术对葡萄糖浓度检测过程中，与该生物传感试纸配套使用的还有信号传感装置，其能够提供电压，检测电流信号，并输出葡萄糖浓度信息。利用本技术中的生物传感试纸对人体内葡萄糖连续检测的方式为：将生物传感试纸的顶端植入人体皮下，底端电极接触口与信号传感装置相连，生物传感试纸的三电极顶部均与间质液接触，信号传感装置提供电压，形成电流回路，工作电极反应区与间质液中的葡萄糖进行反应，产生电流信号，信号传感装置检测电信号进行分析处理，得出葡萄糖浓度信息。
24、本技术第二方面提供了一种如本技术第一方面所述的生物传感试纸的制备方法，当所述生物传感试纸包括一组工作电极、参比电极和对电极时，所述方法包括如下步骤：
25、s1，采用油墨在柔性电极基底上印刷一层工作电极；
26、s2，在所述工作电极上印刷一层第一绝缘层，所述第一绝缘层的顶端起始于所述工作电极的顶端之下，底端止于所述工作电极的底端之上，暴露出所述工作电极的顶端及底端；
27、s3，采用导电银浆在所述第一绝缘层上印刷一层参比电极，所述参比电极的底端与所述工作电极的底端接触，所述参比电极的顶端位于所述第一绝缘层的顶端之上，且参比电极的顶端不与工作电极的顶端接触；
28、s4，在所述参比电极上印刷一层第二绝缘层，所述第二绝缘层的顶端起始于所述参比电极的顶端之下，底端止于所述参比电极的底端之上，暴露出所述参比电极的顶端及底端；
29、s5，采用油墨在所述第二绝缘层上印刷一层对电极，所述对电极的顶端位于所述第二绝缘层的顶端之下，底端与所述参比电极的底端接触；
30、s6，在所述对电极上印刷一层第三绝缘层，所述第三绝缘层的顶端起始于所述对电极的顶端之下，底端止于所述工作电极的底端之下，暴露出所述对电极的顶端；
31、s7，采用反应酶液在所述工作电极的反应区上印刷一层电极酶膜；任选地，采用高聚物溶液在所述电极酶膜上印刷一层限制扩散膜，制得单面的生物传感试纸；
32、当所述生物传感试纸包括两组工作电极、参比电极和对电极时，所述方法包括所述步骤s1-s7，还包括以下步骤：
33、s8，翻转所述单面的生物传感试纸，在所述柔性电极基底的另一面按照所述步骤s1-s7以镜面对称的方式印刷另一组工作电极、参比电极和对电极，制得双面的生物传感试纸。
34、本技术中，以所述生物传感试纸植入人体内的一端为顶端，以与信号传感装置相连的一端为底端；所述工作电极、参比电极、对电极、第一绝缘层、第二绝缘层和第三绝缘层的顶端和底端的方向与生物传感试纸顶端与底端的方向一致。
35、本技术中，对工作电极、参比电极、对电极、第一绝缘层、第二绝缘层和第三绝缘层分别进行印刷后，可以在100～130℃下烘烤30～50min，再进行下一层的印刷。
36、本技术中，对电极酶膜和限制扩散膜印刷后，可以在50～60℃下热处理干燥10～15分钟。
37、在一些实施方式中，所述工作电极、参比电极和对电极印刷时采用的丝网印刷目数为400～420目；所述第一绝缘层、第二绝缘层和第三绝缘层印刷时采用的丝网印刷目数为100～120目。
38、本技术中，对工作电极、参比电极、对电极、第一绝缘层、第二绝缘层和第三绝缘层进行印刷时，丝网印刷的目数会影响印刷厚度，进而对制成的生物传感试纸有较大影响，本技术通过将各层印刷时的印刷目数控制在上述范围内，有助于提升制得的生物传感试纸的检测性能。其中，绝缘层的印刷目数与杂质峰含量相关，印刷目数越大，绝缘层越薄，导致生物传感试纸中的电极物质发生泄漏，检测结果出现杂质峰，影响检测结果的准确性；随绝缘层的印刷目数减小，绝缘层增厚，杂质峰减少，但检测结果的重复性也相对变差；而当将绝缘层的印刷目数控制在100～120目时，无电极物质泄露，杂质峰含量为0，且检测结果的重复性良好。
39、在一些实施方式中，所述工作电极、参比电极和对电极印刷的宽度为0.4～0.6mm。
40、在一些优选的实施方式中，当所述生物传感试纸为双面的生物传感试纸时，所述工作电极、参比电极和对电极印刷的宽度为0.4mm。
41、本技术中，由于生物传感试纸顶端的三电极部分均需植入体内皮下，为兼顾减轻患者不适感及电极的坚固性，需要将工作电极、参比电极和对电极印刷的宽度控制在0.4mm左右。经测试，当电极宽度为0.6mm时，受试者不适感较强，疼痛明显；当电极宽度为0.2mm时，电极插入人体皮下时，有折断风险。同时电极宽度对检测结果的重复性和准确性均有影响，当生物传感试纸为双面的生物传感试纸时，电极宽度为0.4mm能兼顾患者舒适度及检测性能。
42、在一些实施方式中，所述工作电极在印刷后采用电泳法在工作电极的表面形成一层金属氧化物薄膜；所述电泳法的工作电压为1～10v，时间为24～48h。
43、本技术通过对工作电极施加电压后，能在工作电极的表面形成一层金属氧化物薄膜，且电极内的二氧化钛的表面形成三维纳米多孔结构，有助于反应酶的固定和负载。
44、本技术的有益技术效果为：本技术所提供的生物传感试纸能够用于体内葡萄糖的连续检测，该生物传感试纸小巧、便捷，没有毒性，没有电子介质，不存在泄露风险，对人体没有毒害。同时产品稳定，且仅针对葡萄糖，具有非常专一的底物选择性；工作电压低，vc或者对乙酰氨基酚等对检测结果的干扰比较小，且采用葡萄糖脱氢酶进行检测，可以减少空气中氧气的干扰，检测结果更为精准，因此可以较好地应用在人体内血糖的连续检测中，应用前景良好。
1.一种用于体内葡萄糖连续检测的生物传感试纸，其特征在于，所述生物传感试纸包括印刷有工作电极、参比电极和对电极的柔性电极网印片，且所述工作电极的反应区上修饰固定有电极酶膜，所述反应区设置于所述工作电极的顶端。
2.根据权利要求1所述的生物传感试纸，其特征在于，所述柔性电极网印片包括一层柔性电极基底以及一组工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极、参比电极和对电极依次叠加印刷在所述柔性电极基底上，且每层电极上均设置有一层绝缘层。
3.根据权利要求1所述的所述的生物传感试纸，其特征在于，所述柔性电极网印片包括一层柔性电极基底以及两组工作电极、参比电极和对电极，两组工作电极、参比电极和对电极以镜面对称的方式分别依次叠加印刷在柔性电极基底的两面，且每组中的每层电极上均设置有一层绝缘层。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的生物传感试纸，其特征在于，所述工作电极和对电极采用油墨进行印刷，所述油墨中包含20~30wt%的二氧化钛、0.1~1wt%的石墨烯、0.1~1wt%的碳纳米管、10~25wt%的羧酸、2~5wt%的有机溶剂和2~5wt%的表面活性剂。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的生物传感试纸，其特征在于，所述电极酶膜采用反应酶液进行印刷，所述反应酶液中包含1~5wt%的葡萄糖脱氢酶、1~5wt%的还原型辅酶ii、2~5wt%的粘结剂、0.5~1.5wt%的表面活性剂、0.5~1.5wt%的交联剂和2~5wt%的有机溶剂；其中所述葡萄糖脱氢酶和还原型辅酶ii均为经生物工程改造后添加有羟基基团的酶。
6.根据权利要求1-3中任意一项所述的生物传感试纸，其特征在于，所述电极酶膜上还印刷有一层限制扩散膜；所述限制扩散膜通过高聚物溶液进行印刷，所述高聚物溶液中含有5~20wt%的高聚物。
7.根据权利要求1-3中任意一项所述的生物传感试纸，其特征在于，所述生物传感试纸的工作电压为0.05~0.3v，葡萄糖的浓度检测范围为0~33.3mm。
8.一种如权利要求根据权利要求1-7中任意一项所述的生物传感试纸的制备方法，其特征在于，当所述生物传感试纸包括一组工作电极、参比电极和对电极时，所述方法包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述工作电极、参比电极和对电极印刷时采用的丝网印刷目数为400~420目；所述第一绝缘层、第二绝缘层和第三绝缘层印刷时采用的丝网印刷目数为100~120目；和/或
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述工作电极在印刷后采用电泳法在工作电极的表面形成一层金属氧化物薄膜；所述电泳法的工作电压为1~10v，时间为24~48h。
