本发明属于生物，涉及基于鹦鹉热衣原体的inca蛋白或inca基因检测鹦鹉热衣原体的试剂和方法。
背景技术：
1、衣原体是一类革兰氏阴性、具有独特发育周期且严格胞内寄生的病原体，广泛分布于世界各地。鹦鹉热衣原体是衣原体属中人畜共患的一个衣原体种，它的宿主范围非常广泛，能感染自然界中绝大多数的禽类鸟类，牛、羊、猪等家畜也对鹦鹉热衣原体敏感。
2、人类感染鹦鹉热衣原体后通常出现发热、呼吸道炎症等症状。禽类在感染鹦鹉热衣原体后通常呈现出萎靡不振、不进食、羽毛蓬松凌乱、结膜炎、肠炎伴有发烧等轻度和重度症状，导致生产性能降低。牛、羊感染鹦鹉热衣原体后常呈现发热、关节炎、流产等症状。鹦鹉热衣原体的流行给养殖业带来了巨大的经济损失，严重影响畜牧业的发展。鹦鹉热衣原体可以通过气溶胶传播，人们与患病动物及其粪便、羽毛等密切接触时存在很大的感染风险，威胁着人们的身体健康和公共卫生安全。
3、鹦鹉热衣原体全基因序列为1.17mp左右，基因组位于一个环状的染色体上，约有1026个基因和973个蛋白质，并且拥有一个约7.5kbp的环状质粒。
4、目前，国内外检测鹦鹉热衣原体的方式主要分为三类。
5、第一类方法是病原体染色和分离培养，常用的染色方法是荧光抗体染色(也有使用吉姆萨染色等)。虽然染色方法操作简单、检测快，但是灵敏性和特异性一般，离不开专业人员操作，结果判定受主观影响较大。尤其在辨认衣原体具有感染性的原体(elementarybody，eb)和无感染性的始体(initial body)(无感染性的始体亦称网状体，reticulatebody，rb)时相当困难，需要丰富的经验。病原分离培养则多是在鸡胚或细胞中进行，此方法能够保留衣原体的生物特性用于进一步分析，但是灵敏度不高，而且需要专业的实验技术，并且需在生物安全二级实验室以上条件方可进行。
6、第二类方法是核酸检测方法，例如pcr、qpcr、等温扩增等。如以衣原体的ompa为靶序列设计巢式pcr才能将鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、家畜衣原体、肺炎衣原体区分，检测过程较为繁琐。国外一些研究人员针对鹦鹉热衣原体的16s rna、23s rna、ompb、pmp序列设计了引物，尽管针对的靶序列很多，实验方法也在持续改善，但这些基因序列在衣原体科中较为保守，很容易产生交叉，造成检测结果的假阳性，同时也可能因为基因变异造成检测结果的假阴性。实时荧光定量pcr可以直接获得检测结果，无需对扩增产物进行处理，能有效避免污染，但是目前也都是针对鹦鹉热衣原体的衣原体23s rna、ompa序列设计引物和探针，仍然存在上述问题。
7、第三类方法是血清学诊断，常见的有间接血凝实验(iha)、酶联免疫吸附实验(elisa)、补体结合实验(cft)等，它们均可以大规模筛查鹦鹉热衣原体的感染情况。iha和cft操作繁琐、敏感性低、检测时间长、需要较高的专业知识，检测结果受主管判断影响较大。elsia诊断方法快速准确，敏感性高，特异性强，但衣原体科下多种存在病交叉的抗原表位，因此解决elisa假阳性的问题也至关重要。目前，国内外研究者制备了momp蛋白、pomp蛋白、ompa可变区序列的多肽、lps用做抗原来检测患病动物体内是否存在鹦鹉热衣原体抗体，它们都被开发用于cft、elisa、mif，但现有数据表明以这些抗原为基础的抗体检测方法在灵敏度和特异性方面均有待提高。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供基于鹦鹉热衣原体的inca蛋白或inca基因检测鹦鹉热衣原体的试剂和方法。
2、首先，本发明提供了特异引物探针组，由引物cps977f、引物cps1105r和探针cps1010-p组成；
3、所述引物cps977f如seq id no：3所示；
4、所述引物cps1105r如seq id no：4所示；
5、所述探针cps1010-p的核苷酸序列如seq id no：5所示。
6、所述引物探针组以鹦鹉热衣原体的inca基因为靶标。
7、具体的，探针cps1010-p的5’末端具有荧光基团，3’末端具有淬灭基团。
8、具体的，探针cps1010-p的5’末端具有fam荧光基团，3’末端具有tamra淬灭基团。
9、本发明还提供了一种用于鉴定或辅助鉴定鹦鹉热衣原体的试剂，包括特异引物探针组。
10、本发明还提供了一种用于鉴定或辅助鉴定鹦鹉热衣原体的方法，包括如下步骤：利用所述特异引物探针组通过荧光pcr鉴定或辅助鉴定供试微生物是否为鹦鹉热衣原体。所述方法用于非诊断治疗的用途。具体的，所述供试微生物为衣原体。
11、本发明还提供了一种用于检测或辅助检测供试物中是否含有鹦鹉热衣原体的试剂，包括所述特异引物探针组。
12、本发明还提供了一种用于检测或辅助检测供试物中是否含有鹦鹉热衣原体的方法，包括如下步骤：以从供试物提取的dna为模板，利用所述特异引物探针组进行荧光pcr，从而判断供试物中是否含有鹦鹉热衣原体。所述方法用于非诊断治疗的用途。
13、具体的，以上任一所述荧光pcr的反应体系为20μl，由10μl probe qpcr mix(takara公司，产品目录号为rr392a)、cps977f、cps1105r、cps1010-p、1μl模板(dna含量为50ng)和无核酶水组成。反应体系中，cps977f的浓度为0.4μm、cps1105r的浓度为0.4μm、cps1010-p的浓度为0.8μm。
14、具体的，以上任一所述荧光pcr的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s、60℃退火和延伸35s，40个循环。
15、具体的，以上任一所述试剂还包括用于荧光pcr的试剂，例如probe qpcr mix。
16、本发明还提供了所述特异引物探针组的应用，为如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)、(a5)或(a6)：
17、(a1)制备用于鉴定或辅助鉴定鹦鹉热衣原体的试剂盒；
18、(a2)制备用于检测或辅助检测供试物中是否含有鹦鹉热衣原体的试剂盒；
19、(a3)制备用于诊断或辅助诊断鹦鹉热衣原体感染的试剂盒；
20、(a4)用于鉴定或辅助鉴定鹦鹉热衣原体；
21、(a5)用于检测或辅助检测供试物中是否含有鹦鹉热衣原体；
22、(a6)用于诊断或辅助诊断鹦鹉热衣原体感染。
23、具体的，以上任一所述供试物为血清。
24、具体的，以上任一所述供试物来自于动物或人。
25、具体的，以上任一所述动物为哺乳动物。
26、具体的，以上任一所述动物为禽类。
27、具体的，以上任一所述动物为鸟类。
28、示例性的，以上任一所述动物可为鸡、鹦鹉、牛、羊、猪等。
29、本发明还提供了一种蛋白质，命名为dsbc-inca融合蛋白。
30、所述dsbc-inca融合蛋白包括如下两个区段：dsbc区段和inca区段。
31、具体的，所述dsbc-inca融合蛋白依次包括如下两个区段：dsbc区段和inca区段。
32、具体的，所述dsbc-inca融合蛋白依次包括如下三个区段：dsbc区段、inca区段和his6标签。
33、所述dsbc区段如seq id no：2中第1-236位所示。
34、所述inca区段如seq id no：2中第298-639位所示。
35、具体的，所述dsbc-inca融合蛋白如seq id no：2中第1-639位所示。
36、具体的，所述dsbc-inca融合蛋白如seq id no：2所示。
37、本发明还提供了dsbc-inca融合蛋白的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)：
38、(b1)制备用于诊断或辅助诊断鹦鹉热衣原体感染的试剂盒；
39、(b2)制备用于诊断或辅助诊断鹦鹉热衣原体感染的试纸条；
40、(b3)用于诊断或辅助诊断鹦鹉热衣原体感染。
41、所述应用中，所述dsbc-inca融合蛋白作为elisa检测试剂的包被原。
42、所述应用中，所述dsbc-inca融合蛋白作为试纸条的t线的包被物。
43、本发明还提供了一种用于诊断或辅助诊断鹦鹉热衣原体感染的血清学诊断试剂，包括dsbc-inca融合蛋白。
44、本发明还提供了一种用于诊断或辅助诊断鹦鹉热衣原体感染的血清学诊断方法，包括如下步骤：利用dsbc-inca融合蛋白作为包被原，通过elisa进行血清学诊断。所述方法用于非诊断治疗的用途。
45、具体的，所述诊断的对象为动物或人。
46、具体的，以上任一所述动物为哺乳动物。
47、具体的，以上任一所述动物为禽类。
48、具体的，以上任一所述动物为鸟类。
49、示例性的，以上任一所述动物可为鸡、鹦鹉、牛、羊、猪等。
50、示例性的，所述方法包括如下步骤：
51、(1)包被：取96孔透明平底聚苯乙烯微孔板，加入包被液(100μl/孔)，4℃孵育过夜。包被液：dsbc-inca融合蛋白溶液(蛋白浓度为1μg/ml)。
52、(2)封闭：弃除上清，用pbst溶液洗涤3遍(每次1min)，拍干，然后加入封闭液(200μl/孔)，37℃孵育2h。
53、(3)一抗孵育：弃除上清，用pbst溶液洗涤3遍(每次1min)，拍干，然后加入供试溶液(100μl/孔)，37℃孵育2h。
54、供试溶液：取供试血清，用封闭液稀释至250倍体积，即为供试溶液。
55、(4)二抗孵育：弃除上清，用pbst溶液洗涤3遍(每次1min)，拍干，然后加入二抗工作液(100μl/孔)，37℃孵育1h。
56、二抗工作液：取hrp-羊抗鸡igy(immunoway公司，产品目录号为rs2101)，用封闭液稀释至10000倍体积。
57、(5)显色：弃除上清，用pbst溶液洗涤5遍(每次1min)，然后加入tmb显色液(100μl/孔)，避光显色20min。
58、(6)终止：加入终止液(索莱宝公司，产品目录号为c1058)(50μl/孔)，15min内检测od450nm吸光值。
59、待测鸡血清od450nm吸光值大于0.428时判定为阳性，反之则为阴性。
60、本发明还提供了一种用于诊断或辅助诊断鹦鹉热衣原体感染的血清学诊断试纸条,其t线包被dsbc-inca融合蛋白。
61、所述试纸条可为用于动物血清检测的试纸条：胶体金垫上附着胶体金标记的spa(spa即金黄色葡萄球菌蛋白a)；检测垫上具有质控线(又称c线，靠近吸水垫)和检测线(又称t线，靠近胶体金垫)，t线上附着dsbc-inca融合蛋白，c线上附着特异结合spa的抗体。
62、所述试纸条可为用于鸡血清检测的试纸条：胶体金垫上均匀附着胶体金标记的鼠抗鸡igg；检测垫上具有质控线(又称c线，靠近吸水垫)和检测线(又称t线，靠近胶体金垫)，t线上附着dsbc-inca融合蛋白，c线上附着羊抗鼠igg。
63、本发明还提供了一种用于诊断或辅助诊断鹦鹉热衣原体感染的血清学诊断方法，包括如下步骤：采用所述试纸条进行血清学诊断。所述方法用于非诊断治疗的用途。
64、具体的，所述诊断的对象为动物或人。
65、具体的，以上任一所述动物为哺乳动物。
66、具体的，以上任一所述动物为禽类。
67、具体的，以上任一所述动物为鸟类。
68、示例性的，以上任一所述动物可为鸡、鹦鹉、牛、羊、猪等。
69、本发明提供的特异引物探针组以及相应的荧光pcr方法，本发明提供的dsbc-inca融合蛋白以及相应的血清学诊断方法，可用于鹦鹉热衣原体感染的检测，具有检出率高、准确性高、操作简单的优势，可以实现鹦鹉热衣原体的大规模快速筛查以及精确检测，能有效弥补前述检测方法的不足。本发明对于鹦鹉热衣原体的大规模防控具有重大的应用推广价值。
1.特异引物探针组，由引物cps977f、引物cps1105r和探针cps1010-p组成；
2.一种用于鉴定或辅助鉴定鹦鹉热衣原体的试剂，包括权利要求1所述特异引物探针组。
3.一种用于鉴定或辅助鉴定鹦鹉热衣原体的方法，包括如下步骤：利用权利要求1所述特异引物探针组通过荧光pcr鉴定或辅助鉴定供试微生物是否为鹦鹉热衣原体。
4.一种用于检测或辅助检测供试物中是否含有鹦鹉热衣原体的试剂，包括权利要求1所述特异引物探针组。
5.一种用于检测或辅助检测供试物中是否含有鹦鹉热衣原体的方法，包括如下步骤：以从供试物提取的dna为模板，利用权利要求1所述特异引物探针组进行荧光pcr，从而判断供试物中是否含有鹦鹉热衣原体。
6.权利要求1所述引物探针组的应用，为如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)、(a5)或(a6)：
7.一种蛋白质，命名为dsbc-inca融合蛋白；
8.权利要求7所述dsbc-inca融合蛋白的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)：
9.用于诊断或辅助诊断鹦鹉热衣原体感染的血清学诊断试剂或用于诊断或辅助诊断鹦鹉热衣原体感染的血清学诊断试纸条；
10.一种用于诊断或辅助诊断鹦鹉热衣原体感染的血清学诊断方法，包括如下步骤甲或步骤乙：
