本发明属于分子生物，尤其是涉及一种基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna或dna各亚型毒株的通用引物组、试剂盒及其应用与方法。
背景技术：
1、hiv-1是一种rna病毒，具有高度变异性，现已发现hiv-1型m组至少包括9种亚型(a、b、c、d、f、g、h、j、k)，不同亚型之间易发生重组产生独特重组毒株(unique recombinantforms，urfs)。当某种urf在流行过程中趋于形成优势毒株，就成为了流行重组毒株(circulating recombinant forms，crfs)。截止2024年3月，国内外已产生143种crfs，并在流行中占有优势。hiv-1同时也以dna的形式存在，被称为“hiv病毒库”或“hiv前病毒”。无论是hiv-1 rna还是dna，其高度突变为检测带来了挑战性。国际上检测hiv-1 rna定量的扩增方法主要有：荧光定量聚合酶链反应试验(qpcr)、核酸序列依赖性扩增试验(nasba)。qpcr荧光法检测时仅仅需要一对引物和一条探针，nasba法检测时需要一对引物。2种方法对引物数需求少，大大降低了引物设计的困难，特别是降低了设计引物时寻找保守区的困难。但2种方法需要很复杂的成分、配套的仪器、复杂的操作，且结果的解读需要专业人员，在基层或偏远地区很难开展检测。
2、而当下比较常用的一些恒温扩增法，比如环介导等温扩增(lamp)，虽然也有一些研究者尝试使用进行hiv核酸检测，但仅仅限于一些亚型内或者当地的流行毒株，可能是由于hiv-1不同亚型之间的高突变特征使lamp引物设计产生困难。lamp的引物需要6条共计8个区域，每个区域大约20bp的长度，这对于高度突变的hiv-1来说，引物设计难度增加，或者设计出的引物很难覆盖到多种亚型，甚至连几种的优势流行毒株也很难兼容。hiv-1的序列并没有严格的亚型特征，即无法根据某一种亚型的特征进行引物设计。检测方法需要多个保守区引物在面对高突变的hiv-1显然不适合。
3、基于rpa/raa恒温扩增反应仅仅需要一对引物即可完成扩增，经过多个保守区域的多对引物组筛选，灵敏度和特异度可以达到qpcr相同的水平。经过对引物在保守区不同亚型中发生的低突变进行混合碱基的简并修改，达到兼容不同亚型的流行毒株，从而完成在扩增中的引物匹配，提高扩增率。而rpa/raa恒温扩增反应的产物可以和常见的电泳法、荧光法、试纸法相结合进行显示，从而进行结果的定性判断。可以根据实验室条件或者检测现场需求，进行结果判断方法的选择，灵活性极大。rpa/raa恒温扩增反应不需要热循环，对加热设备要求低，反应所需的37℃～42℃使用常见的水浴锅或者金属浴就能完成加热反应。虽然有研究者使用单独的rpa或raa恒温扩增法对hiv-1 rna毒株的其中一种或几种亚型进行检测，但无法覆盖国内流行的各种亚型，真实检测时易发生漏检，或者每次检测只能检测单独的rna或dna中的一种，具有很大的检测局限性。
4、因此，一种对引物覆盖区数量要求低，兼容hiv-1国内常见流行毒株rna或dna、操作简便、灵敏度与特异性等同于qpcr、反应快速、不依赖大型设备适合基层现场的技术开发，有助于快速有效得进行hiv-1核酸检测。
技术实现思路
1、针对现有技术中hiv-1核酸检测存在的操作条件复杂、周期长等局限性问题，本发明提供一种基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna或dna各亚型毒株的引物组、试剂盒及其应用与方法。
2、本发明提供的技术方案不依赖精密仪器，可以在基层现场就能检测hiv-1rna或dna。
3、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
4、本发明第一方面，提供基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna或dna各亚型毒株的简并引物组合，包括扩增引物f与扩增引物r，扩增引物f的核苷酸序列如seq idno.1所示，扩增引物r的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、具体地，
6、f的核苷酸序列为：5’-aagttcaattaggaatmccrcaycchgcagg-3’(seq id no.1)；
7、r的核苷酸序列为：5’-ttggaatattgcyggygatccyttccawccy-3’(seq id no.2)。
8、在本发明的一个实施方式中，基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的简并引物组合中还包括探针。
9、具体地，当基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna或dna各亚型毒株的引物组用荧光法进行定性分析时，除了包括扩增引物f与扩增引物r，还包括exo探针，此外用荧光法进行定性分析时还需要使用核酸外切酶iii，所述exo探针是对基础探针进行碱基修饰后所得的修饰物标记的探针，其中，基础探针的核苷酸序列如seq id no.3所示。
10、具体地，基础探针的核苷酸序列为：
11、5’-attcagaaagtatactgcatttacyataccyagtvbaaacaayga-3’(seq id no.3)。
12、具体地，exo探针的核苷酸序列为：
13、5’-attcagaaagtatactgcatttacyatacc[fam-dt][thf][bhq1-dt]yagtvbaaacaayga-c3-spacer-3’；
14、在本发明的另一个实施方式中，基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的简并引物组合用于核酸试纸法进行定性分析时，除了包括扩增引物f与扩增引物r、还包括nfo探针，此外用于核酸试纸法进行定性分析时还需要使用核酸内切酶iv，所述nfo探针是对基础探针进行碱基修饰后所得的修饰物标记的探针，其中，基础探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；
15、具体地，nfo探针的核苷酸序列为：
16、5’-[fam]attcagaaagtatactgcatttacyatacc[thf]yagtvbaaac aayga-c3-spacer-3’。
17、基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna或dna各亚型毒株的简并引物组合用核酸试纸法进行定性分析时，所述扩增引物r还在5’端增加biotin修饰，即其为修饰物标记的下游引物r，
18、修饰物标记的下游引物r的核苷酸序列为：
19、5’-biotin-ttggaatattgcyggygatccyttccawccy-3’。
20、本发明第二方面，提供一种基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna或dna各亚型毒株的试剂盒，包括扩增引物f与扩增引物r，扩增引物f的核苷酸序列如seq idno.1所示，扩增引物r的核苷酸序列如seq id no.2所示。
21、在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒用于荧光法进行定性分析时，所述试剂盒除了包括扩增引物f与扩增引物r、还包括exo探针以及核酸外切酶iii，所述exo探针是对基础探针进行碱基修饰后所得的修饰物标记的探针，其中，基础探针的核苷酸序列如seqid no.3所示，所述exo探针的核苷酸序列为：
22、5’-attcagaaagtatactgcatttacyatacc[fam-dt][thf][bhq1-dt]yagtvbaaacaayga-c3-spacer-3’。
23、在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒用于核酸试纸法进行定性分析时，所述试剂盒除了包括扩增引物f与扩增引物r，还包括nfo探针以及核酸内切酶iv，所述nfo探针是对基础探针进行碱基修饰后所得的修饰物标记的探针，其中，基础探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；
24、所述nfo探针的核苷酸序列为：
25、5’-[fam]attcagaaagtatactgcatttacyatacc[thf]yagtvbaaac aayga-c3-spacer-3’。
26、更进一步地，当所述试剂盒用核酸试纸法进行定性分析时，所述试剂盒中的扩增引物r还在5’端增加biotin修饰，即其为修饰物标记的下游引物r，
27、修饰物标记的下游引物r的核苷酸序列为：
28、5’-biotin-ttggaatattgcyggygatccyttccawccy-3’。
29、本发明提供的试剂盒使用时，恒温扩增产物与3种显示方法中的任一种进行结合进行定性判断。当选择直接电泳法时，可根据出现218bp的目标条带进行判定；当选择荧光法时，体系中增加核酸外切酶iii和exo探针，根据扩增曲线的起跳时间进行结果的定性判断；当选择核酸试纸法进行定性分析时，体系中增加核酸内切酶iv和nfo探针，并对扩增引物r进行修饰物标记，根据核酸试纸的t线进行结果的定性判断。
30、在本发明的一个实施方式中，基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的试剂盒中，扩增引物f与扩增引物r的浓度均为30μm。
31、在本发明的一个实施方式中，基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的试剂盒中，还包括如下组分：
32、a、含有dntp mix的buffer，醋酸镁；
33、b、逆转录酶，聚合酶重组酶混合物；
34、在本发明的一个实施方式中，基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的试剂盒中，rpa反应时buffer浓度比为2×，醋酸镁为210mm；
35、在本发明的一个实施方式中，基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的试剂盒中，所述逆转录酶浓度为5u/μl，聚合酶重组酶混合物的浓度比均为5×。
36、在本发明的一个实施方式中，基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的试剂盒各亚型毒株，含有dntp mix的2×buffer，反应液包括：浓度为50mm的tris-hc1缓冲液、浓度为100mm的kci、浓度为300um的dntps mix。
37、在本发明的一个实施方式中，基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的试剂盒中，5×聚合酶重组酶混合物包含：浓度为60u的bsu聚合酶、浓度为400ng/ul的reca重组酶、360ng/ul ssb蛋白。rpa与raa的区别为bsu聚合酶的来源不同，反应体系各种酶组分的浓度相同。
38、本发明第三方面，提供基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna或dna各亚型毒株的引物组或基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna或dna各亚型毒株的试剂盒在检测样品中hiv-1 rna或dna各亚型毒株上的应用。
39、本发明第四方面，提供基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna或dna各亚型毒株的方法，利用扩增引物f与扩增引物r，进行等温扩增反应，检测待检样品中的hiv-1rna或dna，扩增引物f的核苷酸序列如seq id no.1所示，扩增引物r的核苷酸序列如seq idno.2所示。
40、在本发明的一个实施方式中，进行基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna或dna各亚型毒株的方法时，当选择直接电泳法时，可根据目的条带位置进行判定；当选择荧光法时，体系中增加核酸外切酶iii和exo探针，根据扩增曲线的起跳时间是否<20分钟ct<20进行结果的定性判断；当选择核酸试纸法进行定性分析时，体系中增加核酸内切酶iv和nfo探针，并对扩增引物r进行修饰物标记，根据核酸试纸的t线进行结果的定性判断。
41、在本发明的一个实施方式中，进行基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna或dna各亚型毒株的方法，包括如下步骤：
42、(1)使用常规核酸抽提方法提取待检样品中的hiv-1核酸作为模板，提取核酸时既可以提取rna，也可以提取前病毒dna，也可同时提取rna和dna，并检测核酸的浓度、纯度和完整性；
43、(2)于加热仪上进行40℃保温20分钟进行恒温扩增反应，加热仪可以为水浴锅、金属浴或者pcr仪等；其中，基于rpa/raa恒温扩增反应体系为30μl反应体系：2×rpa反应buffer 15μl，210mm醋酸镁2.5μl，30μm扩增引物f 0.5μl，30μm扩增引物r 0.5μl，聚合酶重组酶混合物6μl，5u/μl逆转录酶0.5μl，模板3μl，用无rna酶去离子水补足体系为30μl。阴性对照为同体积的无rna酶去离子水代替模板。
44、在本发明的一个实施方式中，进行基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna或dna的方法，如果选择直接电泳法时，使用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，可根据218bp目的条带位置进行判定；当选择荧光法时，体系中增加60u/μl核酸外切酶iii 0.5μl和30μm exo探针0.5μl，体系中的去离子水减少1μl；当选择试纸法进行定性分析时，扩增引物r需要在5’端增加biotin修饰，体积浓度不变，体系中增加20u/μl核酸内切酶iv 1μl和30μm nfo探针0.5μl，体系中的无rna酶去离子水减少1.5μl。
45、(3)待反应完成后，根据基层现场实验室的现有条件选择结果显现方式，可以使用成本最低的琼脂糖凝胶电泳进行结果观测，如果在目的条带218bp的位置出现条带，则说明待检样品中hiv-1阳性；如果未出现条带或由于未发生扩增，引物在60bp位置发生引物二聚体的条带，说明待检样品中hiv-1阴性。
46、当选择荧光法时，体系中增加核酸外切酶iii和exo探针，根据扩增曲线起跳的时间，(设置40度1分钟，每分钟收集一次信号)，当在第20分钟或循环(ct<20)之前出现扩增曲线时，认为说明待检样品中hiv-1 rna或dna阳性；如果没有出现扩增曲线或者在20分钟以后出现非特异的扩增曲线，说明待检样品中hiv-1rna或dna阴性。
47、当选择试纸法进行定性分析时，如果t线和c线同时出现，认为待检样品中hiv-1阳性；如果t线出现，c线未出，检测无效；如果t线未出，c线出现，说明待检样品中hiv-1阴性。
48、采用本发明提供的基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna或dna毒株的引物组、试剂盒及其应用与方法，只需要4种酶混合物和一对扩增引物和一个水浴锅或金属浴就可以开展检测，如果选择荧光法或试纸法进行显示，也仅仅多了一条标记修饰的探针，检测结果裸眼可视。本发明的技术方案对于操作者来说，操作简便并且不需要特别专业的知识背景就可以解读结果。适应性很强，可以根据基层现场的具体实验条件，选择使用电泳法、荧光法或试纸法。本发明通过大量的引物筛选，选出的引物敏感性高，特异性强。由于对仪器有极低的依赖性，在一些基层现场能随时随地灵活进行检测，具有很好的发展前景。
49、本发明在引物设计时通过以下方式来提高检测亚型兼容性，选取ncbi或者losalamos hiv database里的上传的基因序列，进行大量的比对和筛选，找出保守区进行引物设计。本发明在引物设计时通过以下方式来提高检测灵敏性，根据保守区序列，进行多个保守基因区域设计引物，并筛选出灵敏度高的引物组。将筛选到的灵敏度高的引物组与其他病毒进行交叉反应，进行特异性筛选。最终筛选出了敏感性较高的一套引物组，该引物组的灵敏度等同于金标准qpcr。为了提高引物对不同亚型hiv-1的结合效率，对引物进行简并碱基修改，确保引物不会因为保守区的个别碱基突变而导致结合和扩增失败，从而最终提高检测亚型兼容性。该方法扩增反应结束后，可以选择使用电泳法、荧光法或试纸法多种结果观测方法兼容。本发明系首次采用一种基于rpa/raa恒温扩增反应同步检测hiv-1 rna和前病毒dna核酸，具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速、不依赖大型实验设备可在基层现场开展检测工作等优势。
50、与现有技术相比，本发明具有如下的优点及有益效果：
51、(1)本发明中提供的基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1的引物组或试剂盒，既可以检测hiv-1 rna，又可以检测hiv-1前病毒dna核酸，在操作流程上完全一致，对标本类型的兼容性很高。
52、(2)本发明的方法可以将检测时间减少至20分钟。当样本为传统的hiv-1rna时，qpcr需要先反转录约20分钟和扩增40分钟，即使忽略升降温的时间也需要至少60分钟的反应时间。而本发明的快速恒温扩增中，反转录酶和扩增使用的聚合酶重组酶在相同的温度下反应，没有升降温时间，将反转录酶和扩增反应一共所需时间减少至20分钟，反转录和扩增可同步交替进行。缩短了检测周期，对新型恒温扩增技术的开发及微生物的现场检测具有重要的意义。
53、(3)本发明的基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1 rna和dna各亚型毒株的简并引物组合具有亚型兼容性，通过引物序列的简并修改，可以扩增不同亚型的标本。相对其他的恒温扩增，比如lamp需要8个引物保守区，基于rpa/raa恒温扩增反应仅需要2条引物，更易找到不同亚型间高度保守的片段或区域，这对于hiv-1不同亚型间具有高突变性的基因特征来说，是一种更为适合的方法。且检测灵敏度等同于检测金标准的qpcr法。操作简便，快速，对基层现场进行hiv-1的检测工作的开展具有很好应用前景。
54、(4)本发明对仪器要求很低且各种加热设备均可兼容使用，水浴锅、金属浴、普通pcr仪、恒温检测仪，加热到37℃～42℃即可等温条件下扩增。不需要特殊、昂贵的仪器和试剂。
55、(5)该技术的结果观测，可以有电泳法、荧光法或试纸法，可以根据实验室条件灵活进行选择。结果解读也非常容易，三种方法直接观测“有无”进行判断，不需要经过专业培训即可操作。操作简便快捷，检测成本较低。本发明的试剂盒及方法特别适用基层现场检测。
1.一种基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的通用引物组，其特征在于，包括扩增引物f与扩增引物r，扩增引物f的核苷酸序列如seq id no.1所示，扩增引物r的核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.一种基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的试剂盒，其特征在于，包括扩增引物f与扩增引物r，扩增引物f的核苷酸序列如seq id no.1所示，扩增引物r的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.根据权利要求2所述的一种基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于荧光法进行定性分析时，所述试剂盒除了包括扩增引物f与扩增引物r、还包括exo探针以及核酸外切酶iii，所述exo探针是对基础探针进行碱基修饰后所得的修饰物标记的探针，其中，基础探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述exo探针的核苷酸序列为：
4.根据权利要求2所述的一种基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于核酸试纸法进行定性分析时，所述试剂盒除了包括扩增引物f与扩增引物r，还包括nfo探针以及核酸内切酶iv，所述nfo探针是对基础探针进行碱基修饰后所得的修饰物标记的探针，其中，基础探针的核苷酸序列如seq idno.3所示；
5.根据权利要求4所述的一种基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的试剂盒，其特征在于，当所述试剂盒用于核酸试纸法进行定性分析时，所述试剂盒中的扩增引物r还在5’端增加biotin修饰，即其为修饰物标记的下游引物r，
6.根据权利要求2所述的一种基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的试剂盒，其特征在于，试剂盒中，扩增引物f与扩增引物r的浓度均为30μm。
7.根据权利要求2所述的基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的试剂盒，其特征在于，还包括如下组分：
8.权利要求1所述基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的通用引物组或权利要求2-7中任一项所述基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的试剂盒在非疾病诊断治疗目的的检测样品中hiv-1rna或dna各亚型毒株上的应用。
9.一种非疾病诊断治疗目的的基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的方法，其特征在于，使用扩增引物f与扩增引物r进行等温扩增反应，检测待检样品中的hiv-1rna或dna，扩增引物f的核苷酸序列如seq id no.1所示，扩增引物r的核苷酸序列如seq id no.2所示。
10.根据权利要求9所述的一种非疾病诊断治疗目的的基于rpa/raa恒温扩增反应快速检测hiv-1rna或dna各亚型毒株的方法，其特征在于，恒温扩增产物与3种显示方法中的任一种进行结合进行定性判断；
