本发明涉及核酸测序领域。具体地，本发明涉及使用浸泡式反应方案对核酸进行测序的方法，所述浸泡式反应方案包括使其上固定有核酸分子的固体支持物依次浸泡在不同的反应容器中以实现核酸测序。
背景技术：
1、第二代测序技术基于第一代sanger测序技术发展而来，具有低成本，高通量，自动化等特征，极大地推进了基因测序产业的发展。二代测序技术目前已经广泛应用于全基因组测序，转录组测序，宏基因组测序等，是分析生物的进化与分类，研究癌症，孤独症等疾病相关基因，以及进行体外诊断等的有力工具，促进了人们对于生命科学的进一步了解，也推动了健康产业的发展。
2、现有的第二代测序技术主要包括illumina的sbs测序技术(sequencing-by-synthesis，合成法测序)，life technologies公司的半导体测序技术，和bgi的联合探针锚定聚合技术(cpas)。sbs测序技术使用同时具有两个修饰部分(荧光标记和阻断基团)的dntp(datp,dctp,dgtp,dttp)，其中datp、dctp、dgtp、dttp分别携带不同的荧光标记。由于阻断基团的存在，在发生聚合反应时，在每个核酸模板上只会加上一个互补的dntp，检测该dntp所携带的荧光标记即可确定该添加的互补dntp的身份，随后用试剂对可逆阻断基团和荧光标记进行切除(被称为再生反应)，进行下一步聚合反应(p085，基因组学，2016年第一版，杨焕明著)。半导体测序技术利用在模板链延伸时聚合上去的dntp释放的焦磷酸导致的ph值变化，通过芯片底部的传感器检测这一变化从而获得dna链序列信息(p083，基因组学，2016年第一版，杨焕明著)。美国abi公司开发的第二代测序技术方案solid，则是采用sbl测序法(sequencing-by-ligation，连接法测序)来进行高通量测序。solid的sbl测序法使用连接酶和8碱基单链荧光探针混合物，配合不同引物的循环连接，能够实现35-70nt之间的读长，其优势是准确度高(p093，基因组学，2016年第一版，杨焕明著)。联合探针锚定聚合技术(combinatorial probe–anchor synthesis，cpas)使用dna分子锚和荧光探针在dna纳米球(dnb)上进行聚合，随后高分辨率成像系统对光信号进行采集，光信号经过数字化处理后即可获得待测序列；其中，dnb通过线性扩增增强信号，降低单拷贝的错误率(参见bgiseq-500测序平台)。
3、现有二代测序技术的生化反应部分主要采用流道式系统来进行。典型的流道式系统可参见wo2007123744，其使用包括流通池的固体衬底，流通池包括多核苷酸附接于其中的一个或多个流体通道，并通过导流系统将荧光标记试剂可控地流动通过流体通道从而与多核苷酸接触。以illumina的hiseq 2500平台为例，该平台使用流动槽，将测序反应试剂在特定时间点的特定位置从制冷设备泵入流动槽，在一套复杂的流体控制设备的控制下流经测序芯片，并且辅助以精细的温控设施，确保在尽可能短的时间内让生化反应得以充分进行(2500system guide，illumina，2015)。
4、现有二代测序方法需要精确的温度控制和流体控制，成本较高，且容易出现反应不均匀现象。试剂都是一次性使用，利用率较低，进一步提高了测序成本。采用流道式方案的现有二代测序平台如hiseq 2500等还存在通量较低的情况，每一台的通量小于1wgs/天，参考https://www.illumina.com.cn/systems/hiseq_2500_1500/performance_specifications.html。
5、因此，本领域迫切需要新的高通量的、低成本的二代测序方法。
技术实现思路
1、针对现有二代测序方法存在的问题，本发明提供了使用浸泡式反应方案对核酸进行测序的方法，所述浸泡式反应方案包括使其上固定有核酸分子的固体支持物依次浸泡在不同的反应容器中以实现核酸测序。如本文所用的术语“浸泡式反应方案”是相对于现有技术使用的流道式系统而提及的，其意指在对核酸进行测序的过程中，使待测序的核酸移动至与反应试剂接触，而非使用流动通道使反应试剂移动至与核酸接触。所述浸泡式反应方案至少具有以下优势：1.生化试剂重复利用；2.扩展性好，使用灵活，能够大幅提高通量；3.不需要复杂的温度和流体控制系统，反应较均匀；4.显著降低基因测序成本。
2、在本文所述的方法中，核酸测序可以利用多种测序方法实现。测序方法的实例包括但不限于电泳、合成法测序、连接法测序、联合探针锚定聚合测序、杂交测序、单分子测序和实时测序方法。在一些实施方案中，确定靶核酸的核苷酸序列的过程可以是自动化过程。
3、应当理解，任何测序过程都可以结合到本文所述的方法中。此外，应当理解，可以容易地实施其它已知的测序过程，用于本文所述的方法。
4、因此，在一个实施方案中，本发明提供了使用浸泡式反应方案对核酸进行测序的方法，所述浸泡式反应方案包括以下步骤：
5、a.提供其上固定有核酸分子的第一批次的固体支持物，
6、b.将所述第一批次的固体支持物浸泡在一种或多种反应溶液中，以在固体支持物上产生代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号，所述一种或多种反应溶液各自置于分开的反应容器中，
7、其中在将所述第一批次的固体支持物从每一种反应溶液中移出后，洗涤所述第一批次的固体支持物，以除去固体支持物上残留的反应溶液，
8、c.检测所述第一批次的固体支持物上的所述信号，
9、d.将所述第一批次的固体支持物浸泡在置于另外的反应容器中的再生溶液中，以消除固体支持物上的所述信号，
10、e.从再生溶液中移出所述第一批次的固体支持物，洗涤所述第一批次的固体支持物，以除去固体支持物上残留的再生溶液，
11、f.任选地，重复步骤b至e或b至c。
12、在一个实施方案中，步骤b至e可重复一次或多次，例如重复1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多次。
13、在某些实施方案中，洗涤通过将固体支持物浸泡在包含洗涤溶液的反应容器中进行。
14、如本文所用，所述浸泡包括使得固体支持物上固定的所有核酸分子与反应容器中的试剂或溶液接触的任何方式。固体支持物可以例如以垂直、倾斜或水平的方式部分或全部浸泡在反应容器中，条件是固体支持物上固定的所有核酸分子与反应容器中的试剂接触。
15、如本文所用的被测序的“核酸分子”可以是任何类型的核酸，例如核酸可以是脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)或由核苷酸类似物制成的dna或rna的类似物，其可以与“多核苷酸”互换使用。核酸可以是单链的、双链的或含有单链和双链序列两者。核酸分子可以来源于双链dna(dsdna)形式(例如，基因组dna、pcr和扩增产物等)，或者可以来源于如dna(ssdna)或rna的单链形式并且其可以转化为dsdna形式，并且反之亦然。在一些实施方案中，被测序的核酸可以是单分子的形式(可以是天然分子、修饰分子如标记的分子，或包括核苷酸类似物的核酸)、序列的多联体(例如dna纳米球)，等等)，可以扩增(例如扩增为多联体、扩增为多个具有相同或相似序列的个体分子，等等)，和/或可以为任何其它形式。核酸分子的准确序列可以是已知的或未知的。以下是核酸的示例性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、est或sage标签)、基因组dna、基因组dna片段、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna、核糖体rna、核糖酶、cdna、核酸文库、重组多核苷酸、合成多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、任何上述序列的核酸探针、引物或扩增拷贝。
16、核酸可以包括核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸通常含有糖、核碱基和至少一个磷酸基。核苷酸可以是无碱基的(即，缺少核碱基)。核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、修饰的肽核苷酸、修饰磷酸盐糖主链核苷酸及其混合物。核苷酸的实例包括(例如)腺苷一磷酸(amp)、腺苷二磷酸(adp)、腺苷三磷酸(atp)、胸苷一磷酸(tmp)、胸苷二磷酸(tdp)、胸苷三磷酸(ttp)、胞苷酸(cmp)、胞苷二磷酸(cdp)、胞苷三磷酸(ctp)、鸟苷一磷酸(gmp)、鸟苷二磷酸(gdp)、鸟苷三磷酸(gtp)、尿苷一磷酸(ump)、尿苷二磷酸(udp)、尿苷三磷酸(utp)、脱氧腺苷酸(damp)、脱氧腺苷二磷酸(dadp)、脱氧腺苷三磷酸(datp)、脱氧胸腺嘧啶核苷一磷酸(dtmp)、脱氧胸腺嘧啶核苷二磷酸(dtdp)、脱氧胸苷三磷酸(dttp)、去氧胞二磷(dcdp)、脱氧胞苷三磷酸(dctp)、脱氧鸟苷一磷酸(dgmp)、脱氧鸟苷二磷酸(dgdp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、脱氧尿苷一磷酸(dump)、脱氧尿苷二磷酸(dudp)和脱氧尿苷三磷酸(dutp)。还可以在本文所述的方法中使用包含修饰的核碱基的核苷酸类似物。无论是具有天然主链还是类似结构，可以包含在多核苷酸中的示例性修饰的核碱基包括(例如)肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、15-卤代脲嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤素取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鸟嘌呤、3-去氮腺嘌呤等。如本领域中已知的，某些核苷酸类似物不能引入多核苷酸，例如，核苷酸类似物，如腺苷5′-磷酰硫酸。
17、在本发明的具体实施方案中被测序的核酸分子可以具有任意长度。一般说来，有用的核酸的示例性长度包括(例如)至少约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、1,000、5,000或10,000、100,000个核苷酸或更长。作为另外一种选择或者另外，所述长度可以不长于1,000,000、100,000、10,000、1,000、100个核苷酸或更少。核酸分子的长度还可以包括以上示例性数目之间的所有整数。因此，可以使用本发明所述的方法测序的核酸可以(例如)在短多核苷酸、片段、cdna、基因和基因组片段的范围内。
18、在本发明的具体实施方案中进行测序的核酸分子可以为任意数量，例如可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个或者更多个相同或不同的核酸分子。进行测序的核酸分子的数量还可以是例如200、300、400、500、1000、5000、10000、50000、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106或1x107个或更多个相同或不同的核酸分子。进行测序的核酸分子的数量还可以包括以上示例性数目之间的所有整数。
19、核酸可以从任何来源获得。例如，核酸可以由从一种生物获得的核酸分子制备，或者由从包括一种或多种生物的天然来源获得的核酸分子群制备。核酸分子的来源包括但不限于细胞器、细胞、组织、器官或生物体。可以用作核酸分子来源的细胞可以是原核的(例如细菌)；或真核的，如真菌(例如酵母)、植物、原生动物和其它寄生虫，和动物(包括昆虫、线虫)，和哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、猴、非人类灵长类动物和人类)；或者核酸分子可以来源于病毒。
20、在一些实施方案中，核酸可以从特定生物来源获得。在一个优选的实施方案中，核酸是从人获得的人核酸，例如，人组织的样品。在另一个优选的实施方案中，核酸是人线粒体核酸。在另一个优选的实施方案中，核酸可以从宏基因组样品获得。在其它实施方案中，核酸可以从不再包含活生物的环境来源获得。
21、如本文所用的，术语“固定”意指经由共价键或非共价键直接或间接附接至固体支持物。在本公开内容的某些实施方案中，可以使用共价附接，但是通常仅需要的是在期望使用固体支持物的条件下(例如在需要核酸扩增和/或测序的应用中)核酸保持固定或附接至固体支持物。通常，待用作捕获引物或扩增引物的寡核苷酸(例如本发明的具有部分双链结构的引物)被固定，使得3'末端对于酶促延伸是可利用的并且该引物序列的至少一部分能够杂交至互补核酸序列。固定可以经由杂交至表面附接的寡核苷酸发生，在这种情况下固定的寡核苷酸或多核苷酸可以为3'-5'方向。另一种非共价附接的方式可以是通过氨基化修饰将核酸结合蛋白质结合在固体支持物上，并通过核酸结合蛋白质捕获核酸分子。可选地，固定可以通过除碱基配对杂交之外的其他方式发生，例如上文描述的共价附接。核酸与固体支持物附接方式的非限制性示例包括核酸杂交、生物素链霉亲和素结合、巯基结合、光活化结合、共价结合、抗体-抗原、经由水凝胶或其他多孔聚合物的物理限制等。用于将核酸固定在固体支持物上的各种示例性方法可参见例如g.steinberg-tatman等人,bioconjugate chemistry 2006,17,841-848；xu x.等人journal of the americanchemical society 128(2006)9286-9287；美国专利申请us 5639603、us 5641658、us2010248991；国际专利申请wo 2001062982、wo 2001012862、wo 2007111937、wo0006770，为了所有目的，特别是为了与制备形成其上固定有核酸的固体支持物有关的全部教导，以上文献均通过引用全文并入本文。
22、如本文所使用的，术语“固体支持物”意指核酸可以与其附接的任何不可溶的基底或基质，诸如例如，乳胶珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面、玻璃表面、芯片、传感器、电极和硅晶片。固体支持物的表面可以是任何所需形状，所述形状包括，例如，适合用于特定应用的平面的、球形的或多孔的。例如，固体支持物可以是平面的玻璃表面。固体支持物还可以被安装在流动池的内部，以允许与多个试剂的溶液相互作用。
23、在某些实施方案中，固体支持物可以包括惰性基底或基质，该惰性基底或基质已经例如通过应用中间材料的层或涂层被化学官能化，所述中间材料具有允许共价附接至多核苷酸的反应性基团。中间材料可以经由共价键或非共价键直接或间接附接至固体支持物。作为用于非共价附接至固体支持物的非限制性实例，这类支持物可以包括在惰性基底例如玻璃上的聚丙烯酰胺水凝胶层。在这类实施方案中，多核苷酸可以直接共价附接至中间层(例如，水凝胶)，但是中间层本身可以非共价附接至其他基底或基质(例如玻璃基底)层。
24、如本文所用，术语“反应容器”意指能够容纳反应溶液的任何装置，包括但不限于槽、渠、孔、试管、杯、皿等。反应容器可以具有任何合适的形状，例如反应容器可以是方形、球形、锥形、圆柱体形、不规则形状等。反应容器可以具有任何合适的尺寸，例如其尺寸可以根据所需要容纳的反应溶液的体积而进行任意的调整，例如其尺寸可以允许容纳至少1μl、至少5μl、至少10μl、至少20μl、至少50μl、至少100μl、至少1ml、至少5ml、至少10ml、至少20ml、至少50ml、至少100ml、至少200ml、至少500ml、至少1l或更多的反应溶液，或者其尺寸可以允许容纳至多1μl、至多5μl、至多10μl、至多20μl、至多50μl、至多100μl、至多1ml、至多5ml、至多10ml、至多20ml、至多50ml、至多100ml、至多200ml、至多500ml、至多1l或更多的反应溶液。反应容器可由任何合适的材料制成，例如可由玻璃、金属诸如不锈钢、聚合材料如塑料等制成。应理解，反应容器的材料应不会不利地影响反应溶液的反应活性。
25、如本文所用，术语“反应溶液”是指适合用于本文所述的浸泡式反应方案的任何测序方法中所使用的试剂。如本文所述，这样的测序方法可以包括但不限于电泳测序、合成法测序、连接法测序、联合探针锚定聚合测序、杂交测序、单分子测序和实时测序方法。因此，在本发明的浸泡式反应方案中步骤b中所使用的一种或多种反应溶液以及步骤d中所使用的再生溶液取决于所采用的测序方法。根据测序方法确定在本发明的浸泡式反应方案中步骤b中所使用的一种或多种反应溶液以及步骤d中所使用的再生溶液在本领域技术人员的能力范围内。
26、因此，在一个具体的实施方案中，本发明涉及使用本文所述的浸泡式反应方案对核酸分子进行连接法测序的方法。在这样的实施方案中，步骤b的一种或多种反应溶液包含用于在连接法测序中在被测序的核酸分子上产生连接产物并生成代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号的试剂，并且步骤d的再生溶液包含用于从被测序的核酸分子上消除所述信号并使得能够起始下一个连接测序反应的试剂。
27、如本文所用的连接法测序是本领域熟知的各种连接法测序方法。基本地，连接法测序涉及经标记(例如荧光标记)的测序探针和锚定探针(在solid测序中也被称为“引物”)与dna链的杂交和连接。测序探针包含一或两个固定已知的测序碱基(单碱基测序探针或双碱基测序探针)和一系列简并或通用碱基，其使得测序探针与核酸模板之间进行互补配对。锚定探针序列与核酸模板上的衔接子序列(衔接子序列意指核酸模板中的序列已知的寡核苷酸)互补并提供起始连接的位点的已知序列。连接之后，对模板成像并鉴定测序探针中的所述一或两个已知碱基。在锚定探针-测序探针复合物的完全移除或者经过切割除去标记(例如荧光团)之后并再生连接位点之后，开始下一个连接测序循环。
28、因此，在使用本文所述的浸泡式反应方案对核酸分子进行连接法测序的一个实施方案中，步骤b的一种或多种反应溶液包括包含锚定探针、经标记(例如荧光标记)的测序探针、连接酶或其混合物的溶液，前提是固体支持物与锚定探针、经标记的测序探针、连接酶中的每一种均发生接触，并且其中固体支持物上的所述信号由互补结合至固体支持物上的核酸分子的经标记的测序探针产生,所述经标记的测序探针经由连接酶连接至互补结合至同一核酸分子的锚定探针。在使用本文所述的浸泡式反应方案对核酸分子进行连接法测序的另一个实施方案中，在步骤b之前将其上固定有核酸分子的固体支持物与锚定探针(在solid测序中也被称为“引物”)接触，以使得锚定探针杂交至所述固体支持物上的核酸分子，并且步骤b的一种或多种反应溶液包括包含经标记(例如荧光标记)的测序探针、连接酶或其混合物的溶液，前提是固体支持物与经标记的测序探针和连接酶中的每一种均发生接触，并且其中固体支持物上的所述信号由互补结合至固体支持物上的核酸分子的经标记的测序探针产生,所述经标记的测序探针经由连接酶连接至互补结合至同一核酸分子的锚定探针。
29、所述步骤b的一种或多种反应溶液的具体组成取决于所采用的具体连接法测序方法而不同。例如，在采用单一锚定探针的情况下，步骤b的一种或多种反应溶液可以包括仅一种反应溶液，该反应溶液包含连接酶和经标记的测序探针，任选地，还包含锚定探针；或者步骤b的一种或多种反应溶液也可以包括两种反应溶液，其中一种反应溶液包含锚定探针，另一种反应溶液包含经标记的测序探针，并且这两种反应溶液至少之一包含连接酶，在这样的情况下，步骤b包括如下过程：将固体支持物浸泡在包含锚定探针的反应溶液中、洗涤，随后浸泡在包含经标记的测序探针的反应溶液中、洗涤。或者，步骤b的一种或多种反应溶液还可以包括三种反应溶液，其分别包含锚定探针、经标记的测序探针和连接酶，在这样的情况下，步骤b包括如下过程：将固体支持物浸泡在包含锚定探针的反应溶液中、洗涤，随后浸泡在包含经标记的测序探针的反应溶液中、洗涤，随后浸泡在包含连接酶的反应溶液中、洗涤。类似地，在采用双重锚定探针的情况下，步骤b的一种或多种反应溶液可以包括同时包含连接酶、第一锚定探针、第二锚定探针和经标记的测序探针的仅一种反应溶液，或分别包含连接酶、第一锚定探针、第二锚定探针、经标记的测序探针或其混合物的多种反应溶液。
30、关于连接法测序，特别是关于锚定探针、测序探针的描述，可参见例如wo2013066975、美国专利no.60/992,485、61/026,337、61/035,914和61/061,134中的记载。关于连接法测序的详细描述还可参见例如landegren,u.,kaiser,r.,sanders,j.&hood,l.a ligase-mediated gene detection technique.science 241,1077–1080(1988)，美国专利no.6969488、美国专利no.6172218和美国专利no.6306597(其公开内容在此全部引入作为参考)。在优选的实施方案中，连接法测序包括联合探针锚定连接(cpal)测序(参见wo2013066975的记载)。
31、如本文所用，术语“连接酶”是指催化核酸链的5'-磷酸和3'-羟基末端之间磷酸二酯键的分子内形成和分子间形成的核酸修饰酶。连接酶可以获自重组或天然来源。可以使用一种或多种低温(例如，室温或更低)连接酶(例如，t3 dna连接酶、t4 dna连接酶、t7 dna连接酶和/或大肠杆菌dna连接酶)。连接酶也可以是热稳定的连接酶。可以使用来自嗜热生物的热稳定连接酶。热稳定dna连接酶的例子包括但不限于：tth dna连接酶(来自嗜热栖热菌(thermus thermophilus)，可购自例如欧基公司(eurogentec)和genecraft公司)；pfudna连接酶(来自激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)的超嗜热连接酶)；taq连接酶(来自水生栖热菌(thermus aquaticus))，以及任何其他合适的热稳定连接酶，或其任意组合。
32、在另一个具体的实施方案中，本发明涉及使用本文所述的浸泡式反应方案对核酸分子进行合成法测序的方法。在这样的实施方案中，步骤b的一种或多种反应溶液包含用于在合成法测序中以被测序的核酸分子为模板进行聚合反应并生成代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号的试剂，并且步骤d的再生溶液包含用于从被测序的核酸分子上消除所述信号并使得能够起始下一个聚合测序反应的试剂。
33、如本文所用的合成法测序是本领域熟知的各种合成法测序方法。基本地，合成法测序涉及首先将被测序的核酸分子与测序引物杂交，随后在聚合酶的存在下，以被测序的核酸分子为模板在测序引物的3’端聚合经标记(例如荧光标记)的核苷酸。聚合之后，通过检测所述标记来鉴定该经标记的核苷酸。在从经标记的核苷酸上除去标记(例如荧光团)之后，开始下一个聚合测序循环。在一个实施方案中，被测序的核酸分子通过与固定在固体支持物上的测序引物杂交而固定在固体支持物上。在另一个实施方案中，在本发明的浸泡式反应方案中，在步骤b之前将其上固定有核酸分子的固体支持物与测序引物接触，以使得测序引物杂交至所述固体支持物上的核酸分子。
34、因此，在使用本文所述的浸泡式反应方案对核酸分子进行合成法测序的一个实施方案中，步骤b的一种或多种反应溶液包括包含聚合酶、经标记(例如荧光标记)的核苷酸或其混合物的溶液，前提是固体支持物与聚合酶、经标记的核苷酸中的每一种均发生接触，并且其中固体支持物上的所述信号由互补结合至固体支持物上的核酸分子的经标记的核苷酸产生，所述经标记的核苷酸经由聚合酶以固体支持物上的核酸分子为模板聚合至测序引物的3’端。在这样的实施方案中，步骤d的再生溶液包括用于从经标记(例如荧光标记)的核苷酸除去标记的试剂。在使用本文所述的浸泡式反应方案对核酸分子进行合成法测序的优选实施方案中，在步骤b中将固体支持物浸泡在一种反应溶液中，所述反应溶液包含聚合酶和经标记(例如荧光标记)的核苷酸。
35、适合用于合成法测序的经标记(例如荧光标记)的核苷酸以及用于从经标记(例如荧光标记)的核苷酸除去标记的试剂是本领域熟知的，这样的核苷酸和试剂的非限制性实例可参见例如wo04018497、wo04018493、美国专利no.7427673和美国专利no.7057026(其公开内容在此全部引入作为参考)中公开的经标记的核苷酸和用于从经标记的核苷酸除去标记的试剂。
36、在某些实施方案中，经标记的核苷酸还可包含3’阻断基团。所述3’阻断基团在该经标记的核苷酸聚合到生长的核苷酸链上时阻止其他核苷酸的掺入。优选地，3’阻断基团在步骤d中与标记一起除去。合适的3’阻断基团以及用于从核苷酸除去3’阻断基团的试剂是本领域熟知的，这样的3’阻断基团和试剂的非限制性实例可参见例如：greene&wuts，protective groups in organic synthesis，john wiley&sons。guillier；metzker等人(nucleic acids research,22(20):4259-4267,1994)；wo91/06678、wo2002/029003、wo2014139596、wo2004/018497，上述参考文献均通过引用整体并入本文。
37、在优选的实施方案中，经标记的核苷酸上的标记本身可用作3’阻断基团。不受理论约束，例如这样的标记可以具有足以发挥阻断其他核苷酸掺入到多核苷酸链上的大小或结构。所述阻断可能是由于空间位阻造成的，或者可能是由于大小、电荷和结构的组合造成的。在某些实施方案中，经标记的核苷酸上的标记和阻断基团可以是不同的，但优选可采用相同的方式从核苷酸上除去所述标记和阻断基团。在这样的情况下，本文所述的步骤d的再生试剂包含可从经标记的核苷酸上同时除去标记和3’阻断基团的试剂。在另外的一些实施方案中，本文所述的步骤d可以包括将固体支持物分别浸泡到可从经标记的核苷酸上除去标记的试剂和可从经标记的核苷酸上除去3’阻断基团的试剂中。
38、如本文所用，术语“聚合酶”是指合成核酸链或聚合物的酶，包括dna聚合酶和rna聚合酶。优选地，本文所用的聚合酶是dna聚合酶。可以使用的一种聚合酶是sequenasetm(来源于噬菌体7dna聚合酶的酶，其被修饰以改善其测序性质-参见tabor and richarson,proc.nat.acad.sci.usa,84:4767-4771(1987)，可购自例如united states biochemicalcorporation,cleveland,ohio)。可用于代替sequenasetm的其它聚合酶包括但不限于dna聚合酶i的klenow片段，amv逆转录酶以及taq聚合酶。关于可用于本发明的方法的聚合酶的其他描述还可参见wo05024010和wo06120433，其全部内容通过引用并入本文。
39、通常使用的聚合条件是本领域已知的这些酶的聚合条件。在sequenasetm的情况下，聚合条件包括在约室温至约45℃范围内的温度；ph 7至8的缓冲液，优选ph 7.3至7.7；酶浓度为约0.01单位/微升至约1单位/微升，反应时间为约1至约20分钟，优选1至5分钟。用于sequenasetm的典型缓冲液由以下组成：0.040m tris hcl(ph7.5)0.050m氯化钠，0.010m氯化镁，0.010m二硫苏糖醇。在dna聚合酶i的klenow片段的情况下，这些典型的条件包括在约10℃至约45℃范围内的温度，优选约15℃至约40℃；ph 6.8至7.4的缓冲液，优选ph 7.0至7.4；酶浓度为约0.01单位/微升至约1单位/微升，优选约0.02至约0.15单位/微升，反应时间为约1至约40分钟。用于dna聚合酶i的klenow片段的典型缓冲液由以下组成：0.05m三羟甲基氨基甲烷氯化物，ph 7.5 0.05m氯化镁，0.05m氯化钠，0.010m二硫苏糖醇。
40、应当理解，这些条件仅是示例性的。当使用其它聚合酶时，应该使用最适合它们的条件，因为通常希望尽可能快地进行聚合反应。为此，通常对于逆转录酶需要使用42℃的温度；对于klenow聚合酶为24℃；对于sequenasetm为37℃；和对于taq聚合酶为72℃。此外，为了增强反应，特别是在使用经修饰的dntp的情况下，使用显著过量的dntp(超过化学计量)或修饰其他条件如盐浓度可以是有利的。
41、如本文所用，术语“互补”或“基本互补”是指核苷酸或核酸之间的杂交或碱基配对或者双链体形成。如果在一个给定位置上一个核酸的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸形成氢键，则这两个核酸被认为在该位置上是彼此互补的。互补核苷酸一般是a和t(或a和u)或者c和g。当在最佳地比对和比较并适当地进行了核苷酸插入或缺失的情况下，一条链的核苷酸与另一条链的至少大约80％、通常至少大约90％到约95％，甚至大约98％到100％配对时，这两个单链rna或dna分子被称为基本互补。
42、如本文所用，术语“杂交”是指互补的核苷酸或核苷酸碱基之间足够的氢键结合，其可以是，例如，watson-crick，hoogsteen或反向的hoogsteen氢键结合，以使得核酸链之间发生稳定和特异性结合。杂交能力根据严格条件(包括合适的缓冲液浓度和温度，其允许特异性杂交至具有完全或部分互补性区域的靶核酸)确定。因此，不是核酸的所有核苷酸都需要是互补的。此外，当核酸链与靶核酸的所有、部分或重叠区域杂交时，核酸链是“基本互补”的。建立用于设计本发明的寡核苷酸或引物的严格杂交条件的定性和定量考虑事项是本领域已知的，参见，例如，ausubel等人，short protocols in molecular biology(4thed.，john wiley&sons 1999)；sambrook等人，molecular cloning：a laboratory manual(3d ed.，cold spring harbor laboratory press 2001)：nucleic acid hybridisation：a practical approach(b.d.hames&s.j.higgins eds.，irl press 1985)。
43、如本文所用，术语“tm”用于本文通常是指让半数的双链核酸分子解离成单链的温度。计算核酸的tm的公式是本领域公知的。正如标准参考文献指出的，当核酸处于阳离子浓度为0.5m或更低的水溶液中时，可以通过公式tm＝81.5+16.6(log10[na+])0.41(％[g+c])-675/n-1.0m简单估计tm值，(g+c)含量在30％和70％之间，n是碱基数，m是错配碱基对百分比(参见例如，sambrook j等人(2001),molecular cloning,a laboratory manual,(3rd ed.,cold spring harbor laboratory press)。其他参考文献包含更复杂的计算方法，这些方法在计算t m时考虑到结构和序列特性(还可以参见，anderson and young(1985),quantitative filter hybridization,nucleic acid hybridization,和allawiand santa lucia(1997),biochemistry 36:10581-94)。
44、因此，在本发明的具体实施方案中，可以使用合适的温度控制设备来将各个反应容器内的温度调节至其中的反应溶液发生反应或用洗涤溶液洗涤时所需要的温度。在一个实施方案中，各反应容器所需的温度可以是不同的。在另一个实施方案中，各反应容器所需的温度可以是部分相同的。在另一个实施方案中，各反应容器所需的温度可以是相同的。例如，在本文所述的步骤b中分别包含所述一种或多种反应溶液的反应容器的温度可以彼此相同或不同，并且可以与步骤d中的反应容器的温度相同或不同。在一个实施方案中，可以采用一个温度控制设备来控制所有反应容器的温度。在另一个实施方案中，尤其是各反应容器所需的温度不相同的情况下，可以采用不同的温度控制设备来分别控制各反应容器的温度。可用于本发明的方法的合适的温度控制设备是容易获得的，例如可购自市面上可获得的各种温度控制设备，例如水浴锅。在进行核酸测序时，各反应容器的温度可以取决于所采用的测序方法，根据反应容器内进行的反应来常规地确定，各反应容器的温度可以是例如但不限于至少约0℃、至少约5℃、至少约10℃、至少约15℃、至少约20℃、至少约25℃、至少约30℃、至少约35℃、至少约40℃、至少约45℃、至少约50℃、至少约55℃、至少约60℃或更高。在某些情况下，低于0℃的温度可能是需要的。
45、如本文所用，术语“信号”包括能够被检测到的任何信号，包括但不限于光信号、电信号、电磁信号、放射信号等。术语“代表核酸分子的核苷酸序列的信号”意指该信号携带核苷酸序列的信息并能够被解码为被测序的核酸分子的核苷酸序列。例如，在使用经标记(例如荧光标记)的测序探针的情况下，由标记产生的信号携带测序探针的核苷酸序列信息，并且通过该信号可获知被测序的核酸分子上与该测序探针互补配对的位置的核苷酸序列。又例如，在使用经标记(例如荧光标记)的核苷酸的情况下，由标记产生的信号携带核苷酸的身份信息，并且通过该信号可获知被测序的核酸分子上与该核苷酸互补配对的位置的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述信号是荧光信号。在优选的实施方案中，所述标记是荧光标记。检测荧光标记或信号的方式是本领域熟知的。例如，可以通过检测荧光的波长的装置来实现。这样的装置是本领域熟知的。例如，这样的装置可以是共焦扫描显微镜，其用激光扫描固体支持物的表面，以便使直接结合被测序的核酸分子上的荧光团成像。另外，可以例如用灵敏的2-d探测器，如电荷偶连的探测器(ccd)观察所产生的每一种信号。还可以例如使用诸如扫描近场光学显微方法(snom)的其他技术。
46、在一个实施方案中，在步骤c的检测固体支持物上的信号之前，可以将该固体支持物与用于在检测时保护核酸分子、经标记的探针和/或经标记的核苷酸的保护试剂接触，例如将该固体支持物浸泡在包含所述保护试剂的反应容器中。如本文所用的保护试剂可以是例如防止核酸脱水或降解的试剂，防止荧光淬灭的试剂等。这样的保护试剂包括但不限于对苯二胺(ppd)、没食子酸丙酯(npg)、1,4-重氮基二环-辛烷(dabco)、抗坏血酸(维生素c)、vectashield、slowfade、slowfade light等。
47、如本文所用的洗涤溶液是能够将固体支持物上与其非特异性结合的物质洗掉并且不会不利地影响后续反应的任何溶液。适当地，洗涤试剂含有缓冲剂，例如有机盐，以保持约ph 6至ph 9的稳定ph，并且可能还包含一价或二价阳离子，从而从固体支持物除去非特异性结合的分子。示例性的洗涤试剂可以包括例如ph 6.5的100mm tris-hcl缓冲液、te缓冲液(tris-hcl ph 8,10mm和edta,1mm)等。根据需要，在本文所述的浸泡式反应方案中的各步骤中使用的洗涤溶液可以是相同或不同的，并且可以取决于所采用的测序方法而进行适应性调整和选择，这样的调整和选择在本领域技术人员的能力范围内。
48、在本发明的方法中，用于核酸测序的试剂可以或可以不重复使用。例如，步骤b中的一种或多种反应溶液和/或步骤d中的再生溶液可重复使用至少1次，例如重复使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、100次或更多次。因此，在本文所述的浸泡式反应方案的一个实施方案中，方法还包括在步骤f的任选重复步骤b至e的过程中，在每次重复时更换或不更换步骤b的所述一种或多种反应溶液和/或步骤d的所述再生溶液。
49、通常，反应溶液重复使用的次数与测序信号的减弱程度相关，也就是说，如果重复使用反应溶液后测序信号显著减弱以使得测序结果不准确时，这样的重复使用是不合适的，应更换新的反应溶液。在优选实施方案中，步骤b中的一种或多种反应溶液可重复使用至少10次而不显著影响测序信号的强度。在优选实施方案中，步骤d中的再生溶液可重复使用至少20次而不显著影响测序信号的强度。
50、或者，可以根据每次反应过程中反应溶液与固体支持物的反应时间来确定更换反应溶液的时间。每次测序反应过程中反应溶液与固体支持物的反应时间取决于所发生的反应和反应温度。例如，在测序反应的情况下(例如在步骤b的反应容器中)，反应温度可以是适合于所使用的测序酶(例如连接酶或聚合酶)发挥功能所需要的温度，例如可以是至少约5℃、至少约10℃、至少约15℃、至少约20℃、至少约25℃、至少约30℃、至少约35℃、至少约40℃、至少约45℃、至少约50℃、至少约55℃、至少约60℃或更高，例如约10℃至约45℃范围内的温度，优选约15℃至约40℃，这样的温度可以由本领域技术人员根据所使用的测序酶容易地确定。每次测序反应的时间可以是所用的测序酶将经标记的探针或核苷酸掺入到模板核酸链上所需的时间，这样的时间可以由本领域技术人员容易地确定，例如可以是至少1s、至少5s、至少10s、至少15s、至少20s、至少25s、至少30s、至少40s、至少50s、至少1min、至少1.5min、至少2min、至少2.5min、至少3min、至少3.5min、至少4min、至少5min、至少10min、至少15min、至少20min、至少30min或更长时间。又例如，在从经标记的探针或核苷酸除去标记的反应的情况下(例如在步骤d的反应容器中)，反应温度可以是适合于发生所述反应所需要的温度，例如可以是至少约5℃、至少约10℃、至少约15℃、至少约20℃、至少约25℃、至少约30℃、至少约35℃、至少约40℃、至少约45℃、至少约50℃、至少约55℃、至少约60℃或更高，这样的温度可以由本领域技术人员根据所使用的用于从经标记的探针或核苷酸除去标记的方法或试剂容易地确定。这样的反应的时间可以由本领域技术人员容易地确定，例如可以是至少1s、至少5s、至少10s、至少15s、至少20s、至少25s、至少30s、至少40s、至少50s、至少1min、至少1.5min、至少2min、至少2.5min、至少3min、至少3.5min、至少4min、至少5min、至少10min、至少15min、至少20min、至少30min或更长时间。
51、因此，在其中步骤b的测序反应在至少约5℃、至少约10℃、至少约15℃、至少约20℃、至少约25℃、至少约30℃、至少约35℃、至少约40℃、至少约45℃、至少约50℃、至少约55℃、至少约60℃或更高的温度下进行的一个实施方案中，可以以小于或等于约1小时、小于或等于约2小时、小于或等于约3小时、小于或等于约4小时、小于或等于约5小时、小于或等于约6小时、小于或等于约7小时、小于或等于约8小时、小于或等于约9小时、小于或等于约10小时、小于或等于约12小时、小于或等于约15小时、小于或等于约18小时、小于或等于约20小时、小于或等于约22小时、小于或等于约24或更多小时，优选小于或等于约4小时或10小时的时间间隔更换测序反应试剂。在优选的实施方案中，当步骤b的一种或多种反应溶液的反应温度在约55℃以下时，更换步骤b的一种或多种反应溶液的时间间隔为小于约8小时，优选为约4小时。在优选的实施方案中，当步骤b的所述一种或多种反应溶液的反应温度在约45℃以下时，更换步骤b的所述一种或多种反应溶液的时间间隔为小于约24小时，优选为约10小时。
52、与现有二代测序技术采用的流道式反应方案相比，本发明的浸泡式反应方案的不同之处至少还在于：本发明的方法允许同时浸泡多于一个固体支持物，从而极大地提高测序通量。例如，本发明的方法允许同时浸泡2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个固体支持物。这样的同时浸泡的多于一个固体支持物在本文中被称为一个批次的固体支持物。然而，应理解，这样的一个批次的固体支持物也可以仅由一个固体支持物组成。
53、更特别地，本发明的浸泡式反应方案使得固体支持物的嵌套批次处理成为可能。所述嵌套批次处理包括在使用本发明的浸泡式方案对第一批次固体支持物进行核酸测序的过程中，在一个测序循环还未结束时即开始对另一批次固体支持物进行核酸测序，并且在该第二批次固体支持物开始进行核酸测序后，还可以对第三批次固体支持物开始进行核酸测序；类似地，在第n-1批次固体支持物开始进行核酸测序后，可以对第n批次固体支持物开始进行核酸测序，其条件是1≤n≤t循环/t限速，且n为整数值，其中t循环是步骤b至步骤e的总时间(在本文称为一个测序循环的总时间，因此如本文所用的每个“测序循环”开始于在本发明的浸泡式反应方案中将固体支持物浸泡至步骤b的一种或多种反应溶液且结束于步骤e的洗涤该固体支持物)，t限速是在步骤b的每次浸泡、洗涤、步骤c的检测、步骤d的浸泡以及步骤e的洗涤中耗时最长程序的时间(在本文称为限速步骤的时间)。因此，例如，如果一个测序循环的总时间为120秒，并且在该测序循环中的限速程序为步骤c的检测程序，其需要进行40秒，则基于上述等式，n≤120秒/40秒＝3，因而在一个测序循环中，可以最多进行n＝3个批次固体支持物的嵌套批次处理。又例如，如果一个测序循环的总时间为120秒，并且在该测序循环中的限速程序为步骤c的检测程序，其需要进行35秒，则基于上述等式，n≤120秒/35秒＝3.4，因而在一个测序循环中，可以最多进行n＝3个批次固体支持物的嵌套批次处理。在本发明的实施方案中，在一个测序循环中，可以最多进行n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个批次固体支持物的嵌套批次处理。在优选的实施方案中，可以基于限速程序所需要的时间，调整测序循环中其它程序的时间，以使得测序循环的总时间刚好为限速程序所需时间的整倍数。
54、因此，在一个实施方案中，如本文所述的浸泡式反应方案还包括：在将第一批次的固体支持物浸泡在步骤b的一种或多种反应溶液中之后且在步骤e结束之前，将其上固定有核酸分子的第二批次的固体支持物浸泡在步骤b的一种或多种反应溶液中，随后按照步骤b至f操作所述第二批次的固体支持物；任选迭代地重复此过程n-1次，其中1≤n≤t循环/t限速，且n为整数值，其中t循环是步骤b至步骤e的总时间，t限速是在步骤b的每次浸泡、洗涤、步骤c的检测、步骤d的浸泡以及步骤e的洗涤中耗时最长程序的时间。如本文所用，“迭代地重复”意指在将第一批次的固体支持物浸泡在步骤b的一种或多种反应溶液中之后且在步骤e结束之前，任选将其上固定有核酸分子的第二批次的固体支持物浸泡在步骤b的一种或多种反应溶液中，随后在将第二批次的固体支持物浸泡在步骤b的一种或多种反应溶液中之后且在步骤e结束之前，任选将其上固定有核酸分子的第三批次的固体支持物浸泡在步骤b的一种或多种反应溶液中，随后在将第三批次的固体支持物浸泡在步骤b的一种或多种反应溶液中之后且在步骤e结束之前，任选将其上固定有核酸分子的第四批次的固体支持物浸泡在步骤b的一种或多种反应溶液中，以此类推，直到对第n+1批次的固体支持物迭代地重复此过程，其中1≤n≤t循环/t限速，且n为整数值。
55、在实践中，将第n批次的固体支持物浸泡在步骤b的一种或多种反应溶液中与将第n+1批次的固体支持物浸泡在步骤b的一种或多种反应溶液中之间的时间间隔tn满足以下条件：
56、tn≥t限速，且
57、在一个实施方案中，本发明的方法允许一个测序循环使用n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个批次的固体支持物。因此，相比现有的第二代测序技术，本发明的浸泡式反应方案极大地提高了测序通量，并且能够在单位时间内对更多的核酸进行测序。
58、在一个实施方案中，本发明提供的浸泡式反应方案还包括在步骤b的一种或多种反应溶液、步骤d的再生溶液和/或步骤e的洗涤溶液中添加适当量的保湿剂。在优选的实施方案中，在第一反应溶液中添加适当量的保湿剂。不受理论约束，据认为这样的保湿剂的添加可能有助于在将固体支持物从反应溶液和/或洗涤溶液中取出来而暴露于空气时，避免其表面可能因为蒸发和疏水性而导致的干燥。这样的保湿剂包括但不限于多元醇例如甘油、丙二醇、1,3-丁二醇、山梨醇、聚乙二醇等。应理解，这样的保湿剂的添加应不会对反应溶液和/或洗涤溶液、固体支持物以及固体支持物上的核酸分子造成任何不利的影响，并且还不会显著增加固体支持物上携带的试剂的量。在优选的实施方案中，在步骤b的一种或多种反应溶液、步骤d的再生溶液和/或步骤e的洗涤溶液中添加适当量的甘油。添加的保湿剂的量可以是能够使固体支持物表面保持湿润的任何有效量。应理解，这样的量应不会对反应溶液和/或洗涤溶液、固体支持物以及固体支持物上的核酸分子造成任何不利的影响，并且还不会显著增加固体支持物上携带的试剂的量。添加的保湿剂的量可以是例如基于反应溶液和/或洗涤溶液的体积，至少约0.05％、至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约20％或更多的量。在优选的实施方案中，在步骤b的一种或多种反应溶液、步骤d的再生溶液和/或步骤e的洗涤溶液中添加约5％-10％的甘油(v/v)。
59、在一个实施方案中，本发明提供的浸泡式反应方案还包括在步骤b的一种或多种反应溶液、步骤d的再生溶液和/或步骤e的洗涤溶液中添加适当量的用于在将固体支持物从反应溶液和/或洗涤溶液中取出时将固体支持物上残留的反应溶液和/或洗涤溶液中保留在其上的试剂。不受理论约束，据认为这样的试剂的添加可能有助于在将固体支持物从反应溶液和/或洗涤溶液中取出来时，避免固体支持物上残留的反应溶液和/或洗涤溶液可能因重力作用脱离固体支持物上端而导致的干燥。如本文所用，固体支持物的上端意指将固体支持物从溶液中取出时最先暴露于空气中的端部。在优选的实施方案中，这样的试剂可以是例如表面活性剂。这样的表面活性剂可以包括但不限于tween-20、硬脂酸、月桂酸、十二烷基硫酸钠、二辛基琥珀酸磺酸钠(阿洛索-ot)、十二烷基苯磺酸钠、甘胆酸钠、苯扎氯铵、苯扎溴铵、卵磷脂、脂肪酸甘油酯等。应理解，这样的试剂例如表面活性剂的添加应不会对反应溶液和/或洗涤溶液、固体支持物以及固体支持物上的核酸分子造成任何不利的影响，并且还不会显著增加固体支持物上携带的试剂的量。在优选的实施方案中，在步骤b的一种或多种反应溶液、步骤d的再生溶液和/或步骤e的洗涤溶液中添加适当量的tween-20。添加的这样的试剂例如表面活性剂的量可以是能够在将固体支持物从反应溶液和/或洗涤溶液中取出时将固体支持物上残留的反应溶液和/或洗涤溶液中保留在其上的任何有效量。应理解，这样的量应不会对反应溶液和/或洗涤溶液、固体支持物以及固体支持物上的核酸分子造成任何不利的影响，并且还不会显著增加固体支持物上携带的试剂的量。添加的这样的试剂例如表面活性剂的量可以是例如基于反应溶液和/或洗涤溶液的体积，至少约0.001％、至少约0.005％、至少约0.01％、至少约0.02％、至少约0.03％、至少约0.04％、至少约0.05％、至少约0.06％、至少约0.07％、至少约0.08％、至少约0.09％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.8％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％或更多的量。在优选的实施方案中，在步骤b的一种或多种反应溶液、步骤d的再生溶液和/或步骤e的洗涤溶液中添加约0.05％-1％的tween-20(v/v)。
60、在一个实施方案中，本发明提供的浸泡式反应方案还包括优化固体支持物在各反应容器之间的移动速率，以使得固体支持物暴露于空气中的时间最小化。应理解，这样的速率优化应不会对反应溶液、固体支持物以及固体支持物上的核酸分子造成任何不利的影响。
61、因此，在一个具体的实施方案中，优化固体支持物在各反应容器之间的移动速率包括优化固体支持物从反应容器中的溶液或试剂中取出的速率，以使得固体支持物从溶液或试剂中尽可能快地取出而同时不会因较快的取出而对反应溶液、固体支持物以及固体支持物上的核酸分子造成任何不利的影响。不受理论约束，据认为将固体支持物从溶液或试剂中更快地取出有助于避免其表面可能因为蒸发和疏水性而导致的干燥，同时还有助于减少其表面携带的溶液或试剂的量，从而降低对后续程序的污染，然而，过快的取出速率可能会对固体支持物及其上固定的核酸分子带来损害，从而影响测序质量，因而需要根据具体使用的固体支持物、其上固定的核酸分子以及反应溶液或试剂对取出速率进行优化。在一个实施方案中，固体支持物从反应容器中的溶液或试剂中取出的速率可以是例如但不限于至少1mm/s、至少5mm/s、至少10mm/s、至少15mm/s、至少20mm/s、至少25mm/s、至少30mm/s、至少40mm/s、至少50mm/s或更高。在另一个实施方案中，固体支持物从反应容器中的溶液或试剂中取出的速率可以是例如但不限于不高于50mm/s、不高于40mm/s、不高于30mm/s、不高于20mm/s、不高于10mm/s或更低。在优选的实施方案中，固体支持物从反应容器中的溶液或试剂中取出的速率可以是例如约20mm/s。
62、在一个具体的实施方案中，优化固体支持物在各反应容器之间的移动速率包括优化固体支持物在从反应容器中的溶液或试剂中取出后的移动速率，以使得固体支持物暴露于空气中的时间最小化。不受理论约束，据认为在从反应容器中的溶液或试剂中取出后，尽可能快地移动固体支持物有助于避免其表面可能因为蒸发和疏水性而导致的干燥。在一个实施方案中，优化固体支持物在从反应容器中的溶液或试剂中取出后的移动速率，以使得固体支持物暴露于空气中的时间小于或等于100ms、小于或等于200ms、小于或等于500ms、小于或等于1s、小于或等于1.5s、小于或等于2s、小于或等于2.5s、小于或等于3s、小于或等于3.5s、小于或等于4s、小于或等于4.5s、小于或等于5s、小于或等于5.5s、小于或等于6s、小于或等于6.5s、小于或等于7s、小于或等于7.5s、小于或等于8s、小于或等于8.5s、小于或等于9s、小于或等于9.5s、小于或等于10s、小于或等于15s、小于或等于20s、小于或等于30s、小于或等于1min、小于或等于2min、小于或等于5min或小于或等于10min。
63、因此，在优选的实施方案中，本发明提供了使用浸泡式反应方案对核酸进行测序的方法，所述浸泡式反应方案包括以下步骤：
64、a.提供其上固定有核酸分子的第一批次的固体支持物，
65、b.将所述第一批次的固体支持物浸泡在一种或多种反应溶液中，以在固体支持物上产生代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号，所述一种或多种反应溶液各自置于分开的反应容器中，
66、其中在将所述第一批次的固体支持物从每一种反应溶液中移出后，洗涤所述第一批次的固体支持物，以除去固体支持物上残留的反应溶液，
67、c.检测所述第一批次的固体支持物上的所述信号，
68、d.将所述第一批次的固体支持物浸泡在置于另外的反应容器中的再生溶液中，以消除固体支持物上的所述信号，
69、e.从再生溶液中移出所述第一批次的固体支持物，洗涤所述第一批次的固体支持物，以除去固体支持物上残留的再生溶液，
70、f.任选地，重复步骤b至e或b-c，
71、其中任选地在步骤b的一种或多种反应溶液、步骤d的再生溶液和/或步骤e洗涤溶液中添加了保湿剂，例如甘油，和/或表面活性剂，例如tween-20，并且任选地固体支持物在各反应容器之间的移动速率被优化以使得固体支持物暴露于空气中的时间最小化，
72、任选地，所述方法还包括如本文所述的迭代地重复处理第二批次至第n批次(即嵌套批次处理)的固体支持物，其中1≤n≤t循环/t限速，且n为整数值。
73、在另一个优选的实施方案中，本发明提供了使用浸泡式反应方案对核酸进行连接法测序的方法，所述浸泡式反应方案包括以下步骤：
74、a.提供其上固定有核酸分子的第一批次的固体支持物，
75、b.将所述第一批次的固体支持物浸泡在置于反应容器中的反应溶液(在本文称为第一反应溶液)中，所述第一反应溶液包含连接酶和经标记(例如荧光标记)的测序探针，任选地还包含锚定探针，其中在反应容器中，以核酸分子为模板在锚定探针和测序探针之间进行核酸连接反应，和
76、将所述第一批次的固体支持物从第一反应溶液中移出，并洗涤所述第一批次的固体支持物，以除去固体支持物上残留的第一反应溶液，
77、c.检测所述第一批次的固体支持物上的标记，
78、d.将所述第一批次的固体支持物浸泡在置于另外的反应容器中的再生溶液中，所述再生溶液包含可从经标记(例如荧光标记)的测序探针上除去标记的试剂或可将经标记(例如荧光标记)的测序探针从核酸分子上移除的试剂，
79、e.从再生溶液中移出所述第一批次的固体支持物，洗涤所述第一批次的固体支持物，以除去固体支持物上残留的再生溶液，
80、f.任选地，重复步骤b至e或b至c，
81、其中任选地在第一反应溶液、再生溶液和/或洗涤溶液中添加了保湿剂，例如甘油，和/或表面活性剂，例如tween-20，并且任选地固体支持物在各反应容器之间的移动速率被优化以使得固体支持物暴露于空气中的时间最小化，
82、任选地，所述方法还包括如本文所述的迭代地重复处理第二批次至第n批次(即嵌套批次处理)的固体支持物，其中1≤n≤t循环/t限速，且n为整数值。
83、在另一个优选的实施方案中，本发明提供了使用浸泡式反应方案对核酸进行合成法测序的方法，所述浸泡式反应方案包括以下步骤：
84、a.提供其上固定有核酸分子的第一批次的固体支持物，
85、b.将所述第一批次的固体支持物浸泡在置于反应容器中的反应溶液(在本文称为第一反应溶液)中，所述第一反应溶液包含聚合酶和经标记(例如荧光标记)的核苷酸，任选地，所述经标记的核苷酸还可包含3’阻断基团，其中在反应容器中，以核酸分子为模板进行核酸聚合反应，和
86、将所述第一批次的固体支持物从第一反应溶液中移出，并洗涤所述第一批次的固体支持物，以除去固体支持物上残留的第一反应溶液，
87、c.检测所述第一批次的固体支持物上的标记，
88、d.将所述第一批次的固体支持物浸泡在置于另外的反应容器中的再生溶液中，所述再生溶液包含可从经标记(例如荧光标记)的核苷酸上除去标记的试剂，
89、e.从再生溶液中移出所述第一批次的固体支持物，洗涤所述第一批次的固体支持物，以除去固体支持物上残留的再生溶液，
90、f.任选地，重复步骤b至e或b至c，
91、其中任选地在第一反应溶液、再生溶液和/或洗涤溶液中添加了保湿剂，例如甘油，和/或表面活性剂，例如tween-20，并且任选地固体支持物在各反应容器之间的移动速率被优化以使得固体支持物暴露于空气中的时间最小化，
92、任选地，所述方法还包括如本文所述的迭代地重复处理第二批次至第n批次(即嵌套批次处理)的固体支持物，其中1≤n≤t循环/t限速，且n为整数值。
93、在其它实施方案中，本发明还提供了用于本文所述的浸泡式反应方案以对核酸分子进行测序的设备，所述设备包括：
94、a)一个或多个反应容器，其各自包含用于与核酸分子接触以产生代表所述核酸分子的核苷酸序列的信号的反应溶液；
95、b)包含洗涤试剂的一个或多个反应容器；
96、c)包含用于从固体支持物上消除所述信号的反应溶液的反应容器；
97、d)检测所述信号的装置；和
98、e)温度控制设备(例如水浴锅)，其用于控制上述a)至c)中的反应容器的温度。
99、下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是，本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
1.一种使用非流动通道式反应方案对核酸分子进行测序的方法,所述测序方法包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法在步骤c)之后和步骤f)之前还包括以下步骤:
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述固体支持物选自珠子、芯片、玻璃表面、传感器、电极或硅晶片。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述方法包括n个批次的固体支持物，其中n为大于等于1的整数，其中每个批次的固体支持物由至少一个固体支持物组成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述保湿剂为多元醇，优选地，其中保湿剂选自：甘油、丙二醇、1,3-丁二醇、山梨醇、聚乙二醇或其任意组合。
6.根据权利要求1所述的方法,其中步骤b)的一种或多种反应溶液还包含含有聚合酶、测序引物、经标记的核苷酸或其混合物的溶液,使固体支持物与聚合酶、测序引物和经标记的核苷酸中的每一种均发生接触,并且其中固体支持物上的信号由互补结合至固体支持物上的核酸分子的经标记的核苷酸产生,优选地,步骤d)的再生溶液含有能够从经标记的核苷酸上去除标记的试剂,优选地，经标记的核苷酸是经荧光标记的核苷酸，并且优选地,经标记的核苷酸还包含3'阻断基团。
7.根据权利要求1或2所述的方法,所述方法还包括:向步骤b)的洗涤溶液和/或步骤e)的洗涤溶液中添加保湿剂,例如甘油、丙二醇、1,3-丁二醇、山梨醇、聚乙二醇或其任意组合,和/或向步骤b)的一种或多种反应溶液和/或洗涤溶液、步骤d)的再生溶液和/或步骤e)的洗涤溶液中添加用于将固体支持物表面残留的反应溶液和/或洗涤溶液保留在其上的试剂,例如表面活性剂,例如tween-20、硬脂酸、月桂酸、十二烷基硫酸钠、二辛基琥珀酸磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、甘胆酸钠、苯扎氯铵、苯扎溴铵、卵磷脂、脂肪酸甘油酯。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述表面活性剂的量基于溶液的体积计为至少0.001％、至少0.005％、至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.04％、至少0.05％、至少0.06％、至少0.07％、至少0.08％、至少0.09％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％或更多。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述表面活性剂是0.05％-1％(v/v)的tween-20。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述保湿剂的量基于溶液体积计为至少0.05％、至少0.1％、至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％或更多。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)的一种或多种反应溶液和/或洗涤溶液、步骤d)的再生溶液和/或步骤e)的洗涤溶液中添加5％-10％(v/v)的甘油。
12.权利要求1或2所述的方法，其还包括：使用温度控制设备调节各个反应溶液、洗涤溶液或再生溶液的温度。
13.权利要求12所述的方法，其中所述温度控制设备是水浴锅。
14.权利要求1或2所述的方法，其中在步骤f)的任选重复步骤b)至c)或步骤b)至e)的过程中，在每次重复时更换或不更换步骤b)的所述一种或多种反应溶液和/或步骤d)的所述再生溶液。
15.权利要求14所述的方法，其中当步骤b)的所述一种或多种反应溶液的反应温度在55℃以下时，更换步骤b)的所述一种或多种反应溶液的时间间隔为小于8小时，或其中当步骤b)的所述一种或多种反应溶液的反应温度在45℃以下时，更换步骤b)的所述一种或多种反应溶液的时间间隔为小于24小时。
16.用于使用非流动通道式反应方案对核酸分子进行测序的溶液，其特征在于，所述溶液选自聚合反应溶液、再生溶液和洗涤液的一种或多种。
17.根据权利要求16所述的溶液，其中所述溶液包含保湿剂。
18.根据权利要求17所述的溶液,其中所述保湿剂为多元醇，优选地，其中保湿剂选自：甘油、丙二醇、1,3-丁二醇、山梨醇、聚乙二醇或其任意组合。
19.根据权利要求16-18任一项所述的溶液,其中所述溶液还包括包含聚合酶、测序引物、经标记的核苷酸或其混合物的溶液,
20.根据权利要求17所述的溶液，其中所述溶液还包含表面活性剂，所述表面活性剂的量基于溶液的体积计为至少0.001％、至少0.005％、至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.04％、至少0.05％、至少0.06％、至少0.07％、至少0.08％、至少0.09％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％或更多。
21.根据权利要求20所述的溶液，其中所述表面活性剂是0.05％-1％(v/v)的tween-20。
