本发明属于鱼类遗传育种细胞培养领域，具体涉及一种淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系及其培养方法和应用。
背景技术：
1、团头鲂，选自团头鲂耐低氧新品种“浦江2号”，其肉质嫩滑，味道鲜美，是主要的淡水养殖经济作物。杂交鲂鲌是一种淡水养殖鱼类，是利用远缘杂交的育种培育的新品种杂交鱼新品种，其亲本为团头鲂和翘嘴鲌，杂交鲂鲌三倍体不同于杂交鲂鲌二倍体，因其性腺不发育或败育而能够将更多能量用于生长。此外，其不育特性还可以保持杂种优势进而避免继续繁殖造成种质衰退，具备生态安全性。因此，鲂鲌三倍体相较于二倍体更具有优越的生长优势或经济价值。
2、不同于传统哺乳动物实验的独立性，鱼体实验通常具有群体规模大和数量多等特点，鱼类细胞系具有传统鱼体实验不可代替的独特优势，是病毒学、毒理学、免疫学和鱼类资源保护等多个领域的模型工具。相比传统鱼体实验，鱼类细胞具有室内培养、可暴露于不同渗透压环境、成本低、周期短、可重复性高、结果精确等优点。例如鱼类毒理学方面，在细胞系还未分离前只能通过动物体内实验验证毒株的效用和分离毒株，但动物自身的免疫和其实验成本较高，细胞系的出现使病毒学的研究变得简便，病毒增殖可以在细胞中完成，增殖结果可以通过细胞病变效应来判断有无病毒的繁殖，在细胞中实现病毒的分离和收集相对容易。另外，由于鱼体自身具备一定的免疫能力，毒理实验在鱼体实验不具备说服力，而鱼类体外培养的细胞是来自于鱼体但独立于鱼体的一类细胞工具，其可以与污染物直接接触达到明显作用效果。
3、鱼类细胞系在濒危动物的生物资源保护方面具有重要意义，濒危动物具有存在数量少、个体较大、个体脆弱等特点，针对其相关研究的开展具有很大的局限性，但是细胞成为濒危动物生物资源保护的重要工具。最值得注意的是，不同于陆生动物，鱼类通常生活在水中，其捕捞和运输无疑增加实验成本，加之鱼类通常只有一年一度的繁殖季，特定实验的周期较长。目前，团头鲂和杂交鲂鲌三倍体的鳃组织尚未有成功建立的细胞系，培养团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系可以弥补这一空白，可以为后续低氧研究提供载体工具。
技术实现思路
1、鳃作为鱼类的呼吸器官，其在低氧研究中具有重要价值，针对现有的实验只聚焦在组织而在细胞层面尚未涉及，以及现有细胞系中团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞尚未建立的问题，本发明的目的在于提供一种淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系的培养方法，通过组织迁出的方法实现体外培养，得到两株具有分裂能力强、生长速度快和复苏活力高的淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体的鳃细胞系，为后续实验提供可靠的体外研究工具。
2、本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
3、本发明提供一种淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系的培养方法，包括以下步骤：
4、步骤1、选择团头鲂和杂交鲂鲌三倍体为对象，在27～29℃的室温条件下暂养2周，早晚各喂食一次，同时准备原代培养基、传代培养基和试剂；
5、步骤2、原代培养，包括：
6、(2-1)用ms-222进行麻醉，然后用75％的酒精擦拭鱼体，移至超净工作台无菌取鳃组织，放于无菌培养皿内；
7、(2-2)用含有8％青霉素-链霉素-两性b霉素，d-pbs作为漂洗液洗涤3次，洗去包括血液的多余粘液；
8、(2-3)用无菌剪刀将组织切成1mm3小块，转移至25cm2的培养瓶中，加入完全培养基，28℃下静置培养，每3天更换培养基，用倒置荧光显微镜观察组织迁移状况；
9、(2-4)原代培养30～40d，直至覆盖培养瓶底部90％，淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞迁出；
10、步骤3、团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系的传代和冻存，包括：
11、(3-1)将已经覆盖90％培养瓶的团头鲂鳃细胞和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞弃掉原培养基，d-pbs清洗1次；
12、(3-2)加入2ml胰酶-edta消化液消化1min，待消化的细胞变圆逐渐脱落后，加入2ml的m199完全培养基中止消化；
13、(3-3)补充2ml的m199完全培养基，吹散混匀后转移至25cm2培养瓶中，于28℃继续培养；
14、(3-4)向长满的团头鲂鳃细胞和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞中加入2ml的胰酶-edta消化液消化1min，并加入2ml的m199完全培养基中止消化；
15、(3-5)1500rpm/min离心5min，用由90％fbs和10％dmso组成的冻存液重悬细胞并转移至2ml冻存管中，得到的团头鲂鳃细胞命名为mag细胞，杂交鲂鲌三倍体鳃细胞命名为mcg细胞；
16、(3-6)在冻存管上注明细胞的名称、细胞数和冻存日期放入程序降温盒中-80℃过夜，转入液氮中储存；
17、步骤4、团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系的复苏，包括：
18、(4-1)将冻存的mag细胞和mcg细胞从液氮中取出，迅速放入37℃的无菌恒温水浴锅中30s，期间轻轻晃动直至细胞融化；
19、(4-2)加1ml m199完全培养基，以1000rpm/min的转速离心5min，弃去上清液；
20、(4-3)加入4ml完全培养基使细胞重悬，随后将其转入25cm2培养瓶，置于28℃恒温培养箱中，24小时后观察细胞生长状态，48h后更换培养液继续培养，完成复苏。
21、作为优选，步骤1中，所述团头鲂和杂交鲂鲌三倍体的质量均为20-25g。
22、作为优选，步骤1中，所述原代培养基成分包括：以m199培养基为基础添加8％青霉素-链霉素-两性b霉素三抗，20％胎牛血清。
23、作为优选，步骤1中，所述传代培养基成分包括：以m199培养基为基础添加20％fbs，1％青霉素-链霉素-两性b霉素抗生素。
24、作为优选，步骤1中，所述试剂包括0.25％胰酶-edta消化液和d-pbs缓冲液。
25、作为优选，所述mag细胞和mcg细胞经过核型分析，其中mag细胞染色体数为2n＝48，mcg细胞染色体数为3n＝72。
26、本发明还提供一种淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系，通过所述淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系的培养方法得到。
27、本发明还提供所述淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系在低氧胁迫环境中的应用。
28、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
29、1、本发明成功构建团头鲂和杂交鲂鲌三倍体的鳃细胞系，作为氧敏感型鱼类团头鲂的鳃细胞和生长迅速的杂交鲂鲌三倍体鳃细胞，具有增殖周期短、生长快、培养方法简单等特点，成为淡水鱼类研究的重要载体。
30、2、在低氧实验中为比较鳃的变化采用鱼体实验，往往群体胁迫多条鱼来取样获得观察结果，实验成本较高，本发明中团头鲂和杂交鲂鲌三倍体的鳃细胞系为低氧在鳃细胞层面提供可行性代替工具，实验结果更具有直观性，通过显微镜观察即可获得。
31、3、细胞通常贮藏在实验室的液氮罐中，实验环境稳定且不易受环境因素的影响，相比于鱼体实验的实验成本高和实验周期长等特点，细胞系通过复苏后简单传代即可操作，节省时间成本和实验资源，在基因和蛋白质层面的研究具有鱼体不可替代的优势，是重要的体外研究工具。
1.一种淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系的培养方法，其特征在于，步骤1中，所述团头鲂和杂交鲂鲌三倍体的质量为20-25g。
3.根据权利要求1所述淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系的培养方法，其特征在于，步骤1中，所述原代培养基成分包括：以m199培养基为基础添加8％青霉素-链霉素-两性b霉素，20％胎牛血清。
4.根据权利要求1所述淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系的培养方法，其特征在于，步骤1中，所述传代培养基成分包括：以m199培养基为基础添加20％fbs，1％青霉素-链霉素-两性b霉素。
5.根据权利要求1所述淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系的培养方法，其特征在于，步骤1中，所述试剂包括0.25％胰酶-edta消化液和d-pbs缓冲液。
6.根据权利要求1所述淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系的培养方法，其特征在于，所述mag细胞染色体数为2n＝48，mcg细胞染色体数为3n＝72。
7.一种淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系，其特征在于，通过权利要求1至6任一项所述淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系的培养方法得到。
8.权利要求7所述的淡水鱼类团头鲂和杂交鲂鲌三倍体鳃细胞系在低氧胁迫环境中的应用。
