本发明涉及干细胞外泌体冻干粉及口腔含漱液的特定治疗，特别涉及一种外泌体冻干粉的制备方法及其含漱液。
背景技术：
1、口腔黏膜炎，是口腔黏膜的炎性和/或溃疡性、疼痛性疾病，多发于内唇、舌面、两颊等部位，具有复发性、自限性特点，单次病程约7-10d，可并发慢性咽炎、口臭、淋巴结肿大等全身症状。口腔黏膜炎是恶性肿瘤患者，特别是头颈部放化疗治疗过程中常见的不良反应，是由放化疗造成的口腔黏膜上皮细胞损伤所致，据资料统计，其发生率可高达 66% ～75%。它给患者带来了极大的痛苦，影响其进食，并产生治疗恐惧心理，从而导致生活质量下降，甚至阻碍患者进一步接受放化疗。而对于放化疗性口腔黏膜炎，目前临床上缺乏有效的预防手段和疗效良好的药物，积极治疗口腔黏膜炎已成亟需。
2、干细胞具有自我更新能力，并可分化为各种细胞类型，使其成为再生医学的理想选择。干细胞已被证明可以促进组织修复过程，也可以减轻瘢痕形成。干细胞通过分泌外泌体形式的保护因子来创造一个可再生的微环境，从而促进无疤痕创面愈合，进而抑制成肌细胞的形成。因此，干细胞外泌体治疗因其加速伤口愈合和减少瘢痕形成的潜力而受到越来越多的关注。
3、目前治疗口腔黏膜炎的药物多从抑菌、抗炎或者止痛入手，出现了数量众多的喷雾产品。现有的喷雾剂对皮肤存在较大的刺激性，缺乏有效的修复皮肤、口腔黏膜、促进伤口组织愈合的成分，所以往往效果不够理想。而且市面上存在的口腔喷雾剂品类繁多，真正无菌的产品较少，且其配方成分中存在对皮肤、口腔刺激性强的成分，或有非临床级的原料，放化疗患者使用后很难达到理想的效果，且容易产生不良副作用。且目前鲜有间充质干细胞外泌体治疗放疗化疗引起的口腔黏膜炎的报道。
4、口腔黏膜炎，是口腔黏膜的炎性和/或溃疡性、疼痛性疾病，多发于内唇、舌面、两颊等部位，具有复发性、自限性特点，单次病程约7-10d，可并发慢性咽炎、口臭、淋巴结肿大等全身症状。口腔黏膜炎是恶性肿瘤患者，特别是头颈部放化疗治疗过程中常见的不良反应，是由放化疗造成的口腔黏膜上皮细胞损伤所致，据资料统计，其发生率可高达 66% ～75%。它给患者带来了极大的痛苦，影响其进食，并产生治疗恐惧心理，从而导致生活质量下降，甚至阻碍患者进一步接受放化疗。而对于放化疗性口腔黏膜炎，目前临床上缺乏有效的预防手段和疗效良好的药物，积极治疗口腔黏膜炎已成亟需。
5、干细胞具有自我更新能力，并可分化为各种细胞类型，使其成为再生医学的理想选择。干细胞已被证明可以促进组织修复过程，也可以减轻瘢痕形成。干细胞通过分泌外泌体形式的保护因子来创造一个可再生的微环境，从而促进无疤痕创面愈合，进而抑制成肌细胞的形成。因此，干细胞外泌体治疗因其加速伤口愈合和减少瘢痕形成的潜力而受到越来越多的关注。
6、目前治疗口腔黏膜炎的药物多从抑菌、抗炎或者止痛入手，出现了数量众多的喷雾产品。现有的喷雾剂对皮肤存在较大的刺激性，缺乏有效的修复皮肤、口腔黏膜、促进伤口组织愈合的成分，所以往往效果不够理想。而且市面上存在的口腔喷雾剂品类繁多，真正无菌的产品较少，且其配方成分中存在对皮肤、口腔刺激性强的成分，或有非临床级的原料，放化疗患者使用后很难达到理想的效果，且容易产生不良副作用。且目前鲜有间充质干细胞外泌体治疗放疗化疗引起的口腔黏膜炎的报道。
7、间充质干细胞外泌体的制备主要方法包括超高速离心法、密度梯度离心法、体积排阻色谱法、过滤法、聚合物沉淀法、免疫分离、隔离筛选法，都为现有技术下的常用技术手段。下面举出一种常用的制备方法：
8、1.取脐带，无菌分离脐带华通氏胶，剪成组织小块，贴附于培养瓶壁上，加入完全培养基培养，待脐带间充质干细胞爬出后，传代扩增，收集第三代脐带间充质干细胞培养基上清液。
9、2.取间充质干细胞培养基上清液，分装到离心管中，300g离心10min，去除上清液中残留的活细胞，收集上清液。
10、3.将步骤2中收集的上清液分装到离心管中3000g离心30min，去除死细胞，收集上清液。
11、4.将步骤3中收集的上清液分装到洁净的超速离心管中，10000g（平均离心力）离心30min，去除细胞碎片，收集上清液。
12、5.将步骤4收集的上清液，分装到洁净的超速离心管中，100000g（平均离心力）离心90min，弃上清，每管加入生理盐水重悬沉淀。
13、6.将步骤5中的外泌体重悬液转移至离心管，0.22μm的滤器过滤除菌，即为脐带间充质干细胞外泌体溶液。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种外泌体冻干粉的制备方法及其含漱液，其采用脐带间充质干细胞来源的外泌体，制备成外泌体冻干粉，复配溶媒液，用于复溶冻干粉，外泌体冻干粉和溶媒液组成外泌体口腔含漱液套装，用于治疗放疗化疗引起的口腔黏膜炎，具有良好的治疗效果。
2、本发明所采用的技术方案如下：
3、一种外泌体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
4、a、称量，按照如下重量百分比称取原料：甘露醇5-10%，海藻糖0-5%；
5、b、将以上原料充分溶解到0.9%氯化钠溶液中，经过0.2um滤膜过滤除菌，作为冻干保护剂；
6、c、取脐带间充质干细胞外泌体溶液，用所述的冻干保护剂将所述的脐带间充质干细胞外泌体溶液稀释至终浓度为1～100×108 particles/ml，作为冻干前溶液；
7、d、将所述的冻干前溶液无菌分装到无菌玻璃瓶中，真空冷冻干燥后，室温保存，得到外泌体冻干粉。
8、优选的，步骤d中，真空冷冻干燥的具体方法包括：
9、d1、预冻阶段，预冻速率为0.5℃～1℃/min ，预冻温度为-40℃～-50℃，预冻时间为2h～6h；
10、d2、升华干燥阶段，温度范围为-40℃～-10℃，升温速率为 2℃～10℃/h，真空度设置为0～100pa；
11、d3、解析干燥阶段，温度范围为-10℃～25℃,干燥时间10h～20h，真空度设置为0～100pa。
12、优选的，步骤d中，真空冷冻干燥的具体方法包括：
13、d1、预冻阶段，预冻速率为0.5℃/min ，预冻温度为-50℃，预冻时间为4h；
14、d2、升华干燥阶段，温度设置为：在-40℃干燥2h；升高温度至-30℃，干燥2h；升高温度至-20℃干燥2h，最后在-10℃干燥2h；升温速率为 5℃/h，真空度设置为0 pa；
15、d3、解析干燥阶段，温度设置为：在0℃干燥3h，升高至10℃干燥4h；升高至20℃，干燥4h；最后升高至25℃干燥6h，真空度设置为0 pa，干燥时间共17h。
16、优选的，步骤d中，真空冷冻干燥的具体方法包括：
17、d1、预冻阶段，预冻速率为0.5℃/min ，预冻温度为-50℃，预冻时间为4h；
18、d2、升华干燥阶段，温度设置为：在-40℃干燥3h；升高温度至-30℃，干燥3h；升高温度至-20℃干燥3h，最后在-10℃干燥3h；升温速率为 3.5℃/h，真空度设置为0 pa；
19、d3、解析干燥阶段，温度设置为：在0℃干燥2h，升高至10℃干燥4h；升高至20℃，干燥4h；最后升高至25℃干燥4h，真空度设置为0 pa，干燥时间共14h。
20、优选的，一种含漱液，是将所述的外泌体冻干粉与溶媒液以200mg:10ml的比例复溶在一起。
21、优选的，溶媒液按照如下重量百分比称取原料：甘露醇0.5-5%，甘草酸二钾0.1-0.5%，抑甜剂0.01-0.1%；将以上原料充分溶解到超纯水中，经过0.2um滤膜过滤除菌，作为外泌体冻干粉溶媒液。
22、本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
23、1、通过阶段式的真空冷冻干燥方法，将外泌体原料制备成冻干粉，有利于外泌体的保存和运输。
24、2、通过外泌体冻干粉和溶媒液组合的方法，组成外泌体口腔含漱液产品，使用前用溶媒液复溶冻干粉，不但可以最大限度的保留产品中的有效成分，而且便于患者的操作和使用。
25、3、制备过程中使用0.2um滤膜过滤冻干前溶液和溶媒液，可以有效去除原料中的微生物，保证产品的安全性。
1.一种外泌体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤d中，真空冷冻干燥的具体方法包括：
3.根据权利要求1所述的一种外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤d中，真空冷冻干燥的具体方法包括：
4.根据权利要求1所述的一种外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤d中，真空冷冻干燥的具体方法包括：
5.一种含有使用如权利要求1-4任意一项所述的外泌体冻干粉的含漱液，其特征在于，是将所述的外泌体冻干粉与溶媒液以200mg:10ml的比例复溶在一起。
6.根据权利要求5所述的一种含漱液，其特征在于，所述溶媒液按照如下重量百分比称取原料：甘露醇0.5-5%，甘草酸二钾0.1-0.5%，抑甜剂0.01-0.1%；将以上原料充分溶解到超纯水中，经过0.2um滤膜过滤除菌，作为外泌体冻干粉溶媒液。
