本发明涉及生物医药，尤其涉及重组杆状病毒样颗粒，具体涉及一种重组的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
1、犬流感是由犬流感病毒(canine influenza virus，civ)引起的以流涕、咳嗽、发热，甚至死亡为主要临床表现的一种病毒性疾病。2004年在美国的佛罗里达州，h3n8亚型流感病毒由马传播至犬，引起犬呼吸系统疾病，并在犬群内传播，被命名为“3n8亚型犬流感病毒”。近年来，还发现了许多其他亚型，如h1n1、h5n1、h5n2、h10n8等流感病毒感染犬，特别是不同亚型流感病毒感染犬后可出现基因重组现象，现有技术中分离出的h3n1亚型流感病毒为h1n1(ca/09)及h3n2亚型病毒重组的结果。
2、civ不仅对犬的生存和健康带来严重危害，同时也给人类健康带来巨大的风险。犬是人类最亲密的伴侣动物，与人密切接触机会较多，存在犬作为中间宿主将流感病毒传播给人的风险。因此开展犬流感的防控研究具有十分重要的公共卫生意义，而疫苗免疫是防控流感最有效的手段。
3、由于我国目前还没有自主知识产权的h3n2亚型犬流感疫苗，且目前流行的h3n2流感基因型和抗原性与现有的国际上商品化疫苗存在差异，针对现有技术中预防h3n2亚型civ流行株的效果不佳的技术问题，尚未提出有效的解决方案。
技术实现思路
1、本发明的目的是针对现有技术中的至少一个不足，提供一种重组的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒及其制备方法和应用，以解决相关技术中存在的预防h3n2亚型civ流行株的效果不佳的问题。
2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
3、本发明的第一个方面是提供一种重组的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒，其含有a/canine/shanghai/0103/2019(h3n2)的血凝集素(ha)蛋白和神经氨酸酶(na)蛋白。
4、进一步地，所述ha蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。
5、进一步地，所述na蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
6、ha蛋白和na蛋白的序列信息具体如下表所示：
7、
8、本发明的第二个方面提供如第一个方面所述的重组的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：人工合成a/canine/shanghai/0103/2019(h3n2)的ha基因和na基因；将扩增后的ha基因酶切后连接于载体，转化后，挑取白色菌落，提取质粒，获得含有ha基因的重组质粒；将扩增后的na基因酶切后连接于含有ha基因的重组质粒，获得含有ha基因和na基因重组质粒；将含有ha基因和na基因重组质粒的dna在脂质体介导下转染细胞，培养后收集细胞上清，收获同时含有ha蛋白和na蛋白的重组的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒。
9、进一步地，进一步的，所述的载体为pfastbacdual，采用大肠杆菌dh5α进行转化。
10、进一步地，所述重组的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒的制备方法具体包括步骤：
11、s1：从犬流感病毒a/canine/shanghai/0103/2019(h3n2)中获取ha和na基因序列；
12、s2：将ha基因连接于载体，转化后，获取重组质粒pfastbacdual-ha；
13、s3：将na基因连接于重组质粒pfastbacdual-ha，转化后，获取重组质粒pfastbacdual-ha-na；
14、s4：将质粒pfast-bacdual-ha-na转化dh10bac感受态细胞，筛选构建重组转座子bacmid-ha-na；
15、s5：重组转座子bacmid-ha-na进行转染、培养，获取含有ha蛋白和na蛋白的重组的h3n2亚型禽流感病毒样颗粒。
16、进一步地，步骤s1中，所述ha和na基因为采用密码子优化以及人工合成。
17、进一步地，步骤s4中，所述构建重组转座子bacmid-ha-na包含以下步骤：
18、s4-1：将质粒pfast-bacdual-ha-na转化dh10bac感受态细胞；
19、s4-2：经三抗筛选重组转座子bacmid-ha-na；
20、s4-3：提取质粒，阳性杆粒用puc/m13上下游引物进行pcr扩增。
21、进一步地，所述质粒pfast-bacdual-ha-na的稀释浓度为0.2ng/μl，用量为5μl。
22、进一步地，所述三抗为卡那霉素、四环素和庆大霉素。
23、进一步地，步骤s5中，所述转染为采用采用脂质体介导法转染对数生长期的雌性草地贪夜蛾蛹卵巢细胞sf9。
24、本发明的第三个方面是第一个方面所述的重组的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒、或第二个方面中任一所述的制备方法在制备疫苗制剂中的应用。
25、本发明的第四个方面是提供一种犬流感病毒疫苗制剂，含有如第一个方面所述的重组的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒、或含有由第二个方面中任一所述的制备方法制得的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒。
26、进一步地，所述疫苗制剂还包括铝胶佐剂。
27、本发明利用基因合成从犬流感a/canine/shanghai/0103/2019(h3n2)中获得ha和na基因片段(genbank accession numbers mk758007，mk758012，mk758017，mk758022，mk758027，mk758032，mk758037，mk758042)，并同时亚克隆至杆状病毒穿梭质粒pfastbacdual中，构建了重组杆状病毒穿梭质粒，转染sf9昆虫细胞，包装重组杆状病毒bacmid-ha-na。
28、通过western blot法和血凝试验检测ha和na蛋白在sf9细胞中的表达；表达的重组蛋白经透射电镜观察具有病毒样颗粒(virus-like particles，vlps)的形态结构，其结果表明已成功构建了重组杆状病毒，该病毒可同时表达ha、na蛋白，2种蛋白可自行组装成vlps，并分泌至细胞培养上清中，血凝效价可达1：64。
29、本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
30、本发明提供了一种重组的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒，其含有a/canine/shanghai/0103/2019的血凝素(hemagglutinin，ha)和神经氨酸酶(neuraminidase，na)，其中，ha、na能在昆虫细胞内自我组装，呈病毒样颗粒粒子释放到细胞外培养基上清中，表达组装高效，而且h3n2亚型犬流感病毒样颗粒制备方法简单，生产成本低，免疫原性好，无生物安全风险，能够对h3n2亚型犬流感提供保护活性免疫效果，解决了相关技术中存在的预防h3n2亚型civ流行株的效果不佳的问题，在h3n2亚型犬流感的免疫中具有重要的应用价值。
1.一种重组的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒，其特征在于，所述h3n2亚型犬流感病毒样颗粒含有a/canine/shanghai/0103/2019(h3n2)的ha蛋白和na蛋白，所述ha蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示，所述na蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
2.一种如权利要求1所述的重组的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述构建重组转座子bacmid-ha-na包含以下步骤：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
8.一种如权利要求1所述的重组的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒、或如权利要求2～7中任一所述的制备方法在制备疫苗制剂中的应用。
9.一种犬流感病毒的疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂含有如权利要求1所述的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒、或含有由权利要求2～7任一所述的制备方法制备的h3n2亚型犬流感病毒样颗粒。
10.根据权利要求9所述的疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂还包括铝胶佐剂。
