本发明属于分子生物，具体涉及一种扩增用预混液预制板的制备方法。
背景技术：
1、聚合酶链式反应(pcr)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制，pcr的最大特点是能将微量的dna大幅增加。
2、聚合酶链式反应要求体系中由缓冲液、模板核酸、dntp、dna聚合酶和引物组成，这些试剂需要的保存条件各不相同，若dna聚合酶在多次使用中反复冻融会影响其活性，使得反应无法有效进行。但每次实验取用的样本量不一致，导致无法避免的反复冻融dna聚合酶。而每次实验都需要配制一次聚合酶链式反应体系十分费时费力，且不利于试剂的存放和保证试剂的有效性，各种试剂每取用一次都会多一分污染的风险。且dna聚合酶和引物混合后的体系，酶活性会受到存放时间影响，整体保质期会缩短。
3、为此，本领域需要开发一种扩增用预制板，预制板为了保存酶的活性，需要存放在-20℃，这样预制板的密封保存条件也显得尤为重要，不同的封膜材料及方式，也可能对酶的稳定性造成影响，不同材料不同封膜方式对试剂的蒸发会有影响，为此，本申请对如何在长期存放的情况下，不会降低酶活性，又能减少因反复冻融带来的taq酶性能损失进行了探究。
技术实现思路
1、为了解决上述问题中的至少一种，本发明提供了一种扩增用预混液预制板的制备方法。采用该方法制备的预制板，在长期存放的情况下，不会降低酶活性，又能减少因反复冻融带来的taq酶性能损失。
2、为了达到上述目的，本发明采用了如下技术手段：
3、本发明的第一方面提供了一种扩增用预混液预制板的制备方法，包括如下步骤：
4、(1)准备预制板，向预制板的微孔中加入pcr反应所需的扩增试剂；
5、(2)再向微孔中添加bsa缓冲液和/或海藻糖溶液；
6、(3)采用压敏铝膜对预制板进行封膜保存。
7、海藻糖(trehalose)是一种双糖，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，有效的保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。海藻糖具有热稳定性和热激活特性。海藻糖在蛋白热变性过程中可维持蛋白的骨架，保持其天然结构。海藻糖可作为pcr增强剂。通过降低dna双链融解温度，维持taq dna聚合酶稳定性，提高pcr反应效率。
8、bsa即牛血清白蛋白，是酶的稳定剂，防止酶的分解和非特异性吸附；bsa能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的，可能是因为它结构中有17个二硫键，和一个巯基，巯基的化学反应很活泼，二硫键有抗氧化还原的作用，因此可与多种阳离子，阴离子和小分子结合；bsa还能防止酶吸附到管壁而损失。在pcr预混液中加入一定量的bsa即牛血清白蛋白可以延长保存时间，增强酶活性，提高pcr反应效率。
9、在本发明的一些实施方案中，所述bsa缓冲液的浓度为5-20mg/ml。优选地，bsa缓冲液的浓度为10mg/ml。
10、在本发明的一些实施方案中，所述海藻糖溶液的浓度为25-80mg/ml。优选地，海藻糖溶液的浓度为50mg/ml。
11、在本发明的一些实施方案中，bsa缓冲液和海藻糖溶液的混合液中，bsa缓冲液与海藻糖溶液体积比为1：1。
12、在本发明的一些实施方案中，保存条件为：-15～-25℃条件下保存。进一步地，保存时长不超过12个月效果最佳。
13、在本发明的一些实施方案中，所述扩增试剂包括引物、引物稀释溶液以及2×dna聚合酶mix。
14、在本发明的一些实施方案中，所述引物稀释溶液为10mm tris-hcl溶液。
15、使用引物稀释溶液稀释引物：对于浓溶液引物，将一定体积的原溶液转移至合适的新容器中，然后向新容器加入相应体积的稀释溶液；对于干粉引物，先使用少量稀释溶液复溶，转移至合适的新容器中，然后补足稀释溶液。
16、在本发明的一些实施方案中，所述引物浓度为2.5μm。
17、在本发明的一些实施方案中，采用本发明的制备方法制备得到的预制板在pcr扩增试剂盒中的应用。
18、本发明的有益效果
19、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
20、本发明方法使用到的试剂耗材简单易得，不需要额外准备特殊的试剂及耗材；操作简单，不需要在实验中增加多余的操作步骤；可以根据反应量取用需要的试剂，不会反复冻融试剂影响其活性；不需要每次实验都进行繁琐的扩增体系配制，减少试剂污染的风险。
21、加入bsa溶液延长了预混液保存时间，且加强了酶活性。bsa是酶的稳定剂，防止酶的分解和非特异性吸附；bsa能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的，可能是因为它结构中有17个二硫键，和一个巯基，巯基的化学反应很活泼，二硫键有抗氧化还原的作用，因此可与多种阳离子，阴离子和小分子结合；bsa还能防止酶吸附到管壁而损失。
22、保存预混液的预制板使用压敏膜比热敏膜在-15～-25℃保存时，保存效果更好，同时，添加5μl 10mg/ml bsa稳定剂的预制板保存时间最久，在储存12个月后还能保持83％的有效率。
1.一种扩增用预混液预制板的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种扩增用预混液预制板的制备方法，其特征在于：所述bsa缓冲液的浓度为5-20mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种扩增用预混液预制板的制备方法，其特征在于：所述海藻糖溶液的浓度为25-80mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种扩增用预混液预制板的制备方法，其特征在于：bsa缓冲液和海藻糖溶液的混合液中，bsa缓冲液与海藻糖溶液体积比为1：1。
5.根据权利要求1所述的一种扩增用预混液预制板的制备方法，其特征在于：保存条件为：-15～-25℃条件下保存。
6.根据权利要求1所述的一种扩增用预混液预制板的制备方法，其特征在于：所述扩增试剂包括引物、引物稀释溶液以及2×dna聚合酶mix。
7.根据权利要求6所述的一种扩增用预混液预制板的制备方法，其特征在于：所述引物稀释溶液为10mm tris-hcl溶液。
8.根据权利要求6所述的一种扩增用预混液预制板的制备方法，其特征在于：所述引物浓度为2.5μm。
