本发明属于生物，具体涉及一种可视化快速检测莫尼茨绦虫的rpa-lfd引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术：
1、莫尼茨绦虫是牛羊养殖过程中常见的肠道寄生性蠕虫，分类上隶属于裸头科，主要包括扩展莫尼茨绦虫和贝氏莫尼茨绦虫，对我国北方牧区牛羊危害较大。莫尼茨绦虫为大型虫体，致病力强，易在牛羊小肠内集聚成团，造成肠阻塞、扭转或套叠。此外，虫体在肠道内发育快速，夺取大量宿主营养，释放的毒素或分泌物可损害宿主肠粘膜，造成幼畜消瘦、贫血、衰弱、发育迟缓和抗病能力降低，易发生羊快疫等继发感染，严重时可导致幼畜大批死亡，对牛羊养殖业造成严重的经济损失。
2、现阶段，国内对莫尼茨绦虫感染检测及流行病学调查主要依赖于传统的粪便虫卵检查方法和剖检法。粪便虫卵检查多采用沉淀法、漂浮法等分离虫卵，然后在显微镜下观察虫卵形态进行诊断；剖检法则通过在病羊肠道内检出莫尼茨绦虫进行确诊。这些传统诊断方法虽然简单，但费时费力，需专业技术人员检测，存在结果不准确、易发生漏检等问题。另外，虽然各类pcr技术检测病原准确性高，但需要昂贵设备和仪器，反应条件苛刻，仅适于实验室检测，现场即时检测可行性差。随着国内牛羊养殖业的不断发展，建立一种能够检测莫尼茨绦虫感染的简便快速、特异灵敏的即时检测方法，将为进行牛羊个体化驱虫、降低耐药性发生、适时监测和防控牛羊寄生虫病提供有力的技术支持。
3、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)是一种新型的核酸等温快速扩增技术。其反应条件温和，扩增效率高；与侧流层析试纸条(lateralflow dipstick，lfd)联合使用，可实现现场快速准确的可视化检测。在rpa-lfd反应体系中，需设计带有修饰基团的引物和探针；其中反向引物5'端一般标记生物素(biotin)；分子探针的5'端修饰抗原标记，如6-羧基荧光素(6-fam)和异硫氰酸荧光素(fitc)等，中间位置(距5'端约30nt)处标记一个核酸外切酶nfo识别位点(四氢呋喃，thf)，3'末端标记一个聚合酶封闭基团(如c3-spacer、胺基、磷酸基团等)。反应时nfo酶切开探针的thf位点，产生自由的3'-oh与dna聚合酶结合启动延伸，形成带有fam与biotin的双标记扩增子；扩增子上的fam可与lfd中金标记fam抗体结合形成抗原抗体复合物，泳动至检测区，扩增子携带的biotin与检测线上包被的生物素抗体结合显色；泳动至对照区，则与对照线上包被的特殊抗体结合显色。rpa-lfd反应一般在39～42℃恒温条件下实现目标dna片段的超快速扩增，15～30min即可完成扩增产物快速检测；无需昂贵仪器设备、操作简单、快速灵敏，检测条件优于常规pcr、lamp等；肉眼直观判读结果，适用于养殖现场检测。此外，在感染牛羊未出现典型病症之前进行准确诊断并实施个体化驱虫，可有效避免群体耐药性的发生和疫病流行，具有较好的应用前景。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种可视化快速检测莫尼茨绦虫的rpa-lfd引物、探针、试剂盒及方法，以克服传统虫卵镜检需专业技术人员及其他核酸扩增技术反应条件苛刻的问题，开发一种简便快速、灵敏度高、特异性好、结果准确，且不依赖于昂贵仪器，适用于养殖现场牛羊粪便中莫尼茨绦虫的可视化快速检测方法。
2、本发明创新性在于：
3、本发明首次以莫尼茨绦虫β微管蛋白基因(m-β-tubulin)为靶标分子进行rpa-lfd检测。靶序列是通过blat软件将m-β-tubulin(genbank：jn980967)基因序列比对到莫尼茨绦虫基因组(genbank：jadfdv010000485.1)序列上；获取其位置信息后使用mega v11软件将比对序列进行可视化分析，选取m-β-tubulin(106bp～1553bp位点)与基因组(325580bp～327027bp位点)匹配的无gap重合区域作为标记序列；实现以待检样品dna为模板进行靶基因简单高效扩增的目的；该片段序列长度为1448bp。进一步地，将该标记序列与genbank和wormbase数据库中已公布的常见动物肠道蠕虫的β-tubulin进行多序列比对，选择m-β-tubulin特异性位点设计多条引物和探针；经扩增、显色等鉴定筛选获得最佳的rpa-lfd扩增引物和探针组合。
4、为实现其目的，本发明采用如下技术方案：
5、本发明提供的一种可视化快速检测莫尼茨绦虫的rpa-lfd引物和探针，其中，所述rpa-lfd引物序列为：
6、正向引物：5'-tcaaccgtgccatccccaaaagtatccgacgtg-3'(seq id no.1)；
7、反向引物：[5'-biotin]-taacttctatatgcttgtgtataacggcttgttaa-3'(seq idno.2)；
8、所述rpa-lfd探针序列为：
9、[5'-6-fam]-tcgtcgagccctacaatgccacgctctctt[thf]ccaccaattaattga-[3'-spacer c3]；
10、所述引物和探针对应的特异性扩增片段位于m-β-tubulin基因(genbank：jn980967)与莫尼茨绦虫基因组(325580bp～327027bp)匹配的无gap重合区域的第550bp～899bp位点之间，大小为350bp，核苷酸序列如seq id no.3所示，直接以待检样品dna为模板进行靶基因扩增。
11、seq id no.3：
12、5'-tcaaccgtgccatccccaaaagtatccgacgtggtcgtcgagccctacaatgcca cgctctctttccaccaattaattgagaacacggatgagacttactgtattgacaatgaagctctatatgacatttgtagcaggaccctcaaattagtgactccaacttacggcgatctgaatcatctggccagcgccactatgtctggggtgactacctgtctacgtttccctggtcaactgaacgcagatttgagaaagctagctactaacatggttccctttccaagactccattttttcatgcccggattctctccattaacaagccgttatacacaagcatatagaagtta-3'。
13、本发明提供的一种可视化快速检测莫尼茨绦虫的rpa-lfd试剂盒，包含上述引物和探针。
14、进一步地，所述试剂盒还包含标准阳性质粒；
15、所述标准阳性质粒是通过克隆m-β-tubulin基因106bp～1335bp片段，连接至pmd18-t载体转化大肠杆菌感受态细胞dh5a；挑选阳性克隆测序鉴定正确后，进行菌液扩增并提取质粒，即为莫尼茨绦虫标准阳性质粒pmd18-t-m-β-tubulin，其作为试剂盒阳性对照，浓度为50ng/μl。
16、进一步地，所述试剂盒还包含去离子水(ddh2o)、扩增试剂和侧流层析试纸条；
17、所述扩增试剂为以dna为模板的试纸条型rpa扩增试剂；
18、所述侧流层析试纸条为能够捕获6×fam和biotin标签的结果可视化核酸检测试纸条；
19、所述试剂盒的rpa-lfd扩增体系为：在含rpa冻干酶粉反应管中依次加入再水合缓冲液29.4μl，正反向引物(10μm)各2μl，探针(10μm)0.6μl，dna模板(40～50ng/μl)5μl，去离子水8.5μl，醋酸镁缓冲液2.5μl，充分混匀。
20、更进一步地，所述试剂盒的rpa-lfd反应条件为：将所述反应管上下颠倒混匀，瞬时离心至管底，置39℃温育15min。
21、本发明提供的一种莫尼茨绦虫的rpa-lfd可视化快速检测方法，包括以下步骤：
22、(1)提取莫尼茨绦虫待检粪样dna；
23、(2)以步骤(1)提取的粪样dna为模板，利用上述试剂盒进行rpa-lfd反应，得到rpa双标记扩增子；
24、(3)应用侧流层析试纸条对步骤(2)中rpa双标记扩增子进行可视化结果判定。
25、进一步地，所述rpa双标记扩增子为带有fam和biotin双标记的扩增子。
26、进一步地，所述侧流层析试纸条检测方法为：用去离子水将所述rpa双标记扩增子进行20倍稀释后混匀，滴入侧流层析试纸加样孔中，50μl/孔，室温静置，5min内观察结果。
27、采用本发明检测方法，所述莫尼茨绦虫基因组dna的最低检出限为100pg/μl。
28、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
29、(1)通过对反向引物和探针的标记和修饰，首次在莫尼茨绦虫m-β-tubulin基因(genbank：jn980967)的第550bp～899bp位点设计出最佳引物和探针组合，建立的rpa-lfd方法检测结果肉眼可见，不需要荧光检测仪、pcr仪、核酸电泳仪和凝胶成像仪等复杂昂贵的仪器设备；
30、(2)检测时间短，核酸扩增和结果显色可在30min内完成；
31、(3)检测灵敏度高，虫体dna最低检测限可达100pg/μl，标准质粒最低检测限达1.9×103copies/μl；
32、(4)特异性高，与包括隐孢子虫、肝片吸虫、前后盘吸虫、日本血吸虫、鞭虫、古柏线虫、仰口线虫和捻转血矛线虫在内的常见牛羊消化道寄生虫均无交叉反应。
33、综上，本发明方法可实现现场或田间便携式可视化快速检测，在牛羊莫尼茨绦虫感染检测、个体化驱虫及综合防控方面具有很高的临床应用价值。
1.一种可视化快速检测莫尼茨绦虫的rpa-lfd引物和探针，其特征在于，所述rpa-lfd引物序列为：
2.一种可视化快速检测莫尼茨绦虫的rpa-lfd试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的引物和探针。
3.如权利要求2所述的一种可视化快速检测莫尼茨绦虫的rpa-lfd试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含标准阳性质粒；
4.如权利要求3所述的一种可视化快速检测莫尼茨绦虫的rpa-lfd试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含去离子水、扩增试剂和侧流层析试纸条；
5.如权利要求4所述的一种可视化快速检测莫尼茨绦虫的rpa-lfd试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的rpa-lfd反应条件为：将所述反应管上下颠倒混匀，瞬时离心至管底，置39℃温育15min。
6.一种莫尼茨绦虫的rpa-lfd可视化快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的一种莫尼茨绦虫的rpa-lfd可视化快速检测方法，其特征在于，所述rpa双标记扩增子为带有fam和biotin双标记的扩增子。
8.如权利要求7所述的一种莫尼茨绦虫的rpa-lfd可视化快速检测方法，其特征在于，所述侧流层析试纸条检测方法为：用去离子水将所述rpa双标记扩增子进行20倍稀释后混匀，滴入侧流层析试纸加样孔中，50μl/孔，室温静置，5min内观察结果。
9.如权利要求7或8所述的一种莫尼茨绦虫的rpa-lfd可视化快速检测方法，其特征在于，所述莫尼茨绦虫基因组dna的最低检出限为100pg/μl。
