本发明涉及葡聚糖，具体涉及一种β-1,3-葡聚糖的制备方法及其在生物诱导植物防病抗病中的应用。
背景技术：
1、β-1,3-葡聚糖是一类广泛存在于微生物、植物、动物体内的大分子多糖，主链结构由β-1,3-糖苷键连接，通常还含有不同比例和大小的β-1,3键、β-1,4键、β-1,6 键连接的支链，主要以细胞结构成分如细胞壁的形式存在，对异体宿主防御系统具有较强的诱导和活化作用。经研究发现，β-1,3-葡聚糖具有免疫调节、抗菌、抗氧化、抗衰老、抗炎、抗肿瘤、降血糖、降血脂等作用，在医药、食品、化妆品等领域应用非常广泛。随着对β-1,3-葡聚糖研究的不断深入，发现β-1,3-葡聚糖能够刺激植物产生防御反应，将其施用于植物上，能够通过生物诱导因子诱发植物产生抗性，提高植物防病抗病能力。
2、β-1,3-葡聚糖主要来源于酵母、谷物、真菌、藻类，其中，酵母的细胞壁中含有大量β-1,3-葡聚糖，且由酵母提取的β-1,3-葡聚糖的生物活性最强，因此，酵母是β-1,3-葡聚糖的最佳来源。
3、酵母细胞壁的成分主要包括葡聚糖、甘露糖、蛋白质、氨基酸、磷脂等，其中的葡聚糖为β-葡聚糖，主链由β-1,3-糖苷键组成，支链由β-1,6-糖苷键组成，具有三螺旋结构，分子内多羟基存在相互作用形成氢键，导致亲水基团内敛，因此不溶于水、乙醇、丙酮等有机溶剂。
4、目前，对酵母中β-1,3-葡聚糖的提取方法主要有酸碱综合提取法、酶提取法、氧化提取法；其中，酸碱综合提取法得到的β-1,3-葡聚糖的纯度高，但是高温酸性环境和高温碱性环境会对β-1,3-葡聚糖的分子结构造成破坏，得率低；酶提取法中使用的酶一般为碱性蛋白酶，该方法对β-1,3-葡聚糖的分子结构破坏小，得到的β-1,3-葡聚糖的得率高，但是酶的专一性强，仅仅通过一种碱性蛋白酶，很难将所有杂质完全去除，导致得到的β-1,3-葡聚糖的纯度低，且酶解效率低，导致酶解时间长；氧化提取法中使用的氧化剂一般为次氯酸钠，该方法得到的β-1,3-葡聚糖的得率高，但是很难将所有杂质去除，导致得到的β-1,3-葡聚糖的纯度低，且所需要的氧化时间长。
5、此外，经过对β-1,3-葡聚糖的进一步研究发现，从酵母中提取得到的β-1,3-葡聚糖的水溶性差，在应用于植物中，用于提高植物的防病抗病能力时，会由于溶解性差导致利用率低，为了提高β-1,3-葡聚糖的水溶性，检索到的技术方案主要有以下三种：化学降解、物理降解、生物降解。但是化学降解和生物降解均对β-1,3-葡聚糖的分子结构影响大，从而影响了β-1,3-葡聚糖的应用效果；物理降解中的超声降解，主要通过破坏分子内羟基的相互作用，导致部分亲水基团外露，从而提高了β-1,3-葡聚糖的亲水性，通过超声降解的方法对β-1,3-葡聚糖的分子结构影响小，从而避免了对β-1,3-葡聚糖的应用效果的影响，但是超声降解的降解作用弱，对β-1,3-葡聚糖的亲水性的提高作用小。
6、综上所述，β-1,3-葡聚糖的制备中，主要存在的问题在于很难提高β-1,3-葡聚糖的得率和纯度的同时，缩短制备时间；β-1,3-葡聚糖在生物诱导植物防病抗病中的应用中，主要存在的问题在于很难提高β-1,3-葡聚糖的亲水性的同时，避免对β-1,3-葡聚糖的分子结构的影响，即避免对β-1,3-葡聚糖的应用效果的影响。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种β-1,3-葡聚糖的制备方法及其在生物诱导植物防病抗病中的应用，对于β-1,3-葡聚糖的制备方法，能够提高β-1,3-葡聚糖的得率和纯度的同时，缩短制备时间，对于β-1,3-葡聚糖在生物诱导植物防病抗病中的应用，能够提高β-1,3-葡聚糖的水溶性的同时，避免对β-1,3-葡聚糖的应用效果的影响。
2、为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
3、一种β-1,3-葡聚糖的制备方法，由以下步骤组成：酶解，去杂；
4、所述酶解，将酵母细胞壁粉末与超纯水混合后，在90-95℃下以50-100rpm的搅拌速度搅拌1.5-2h，降温至55-65℃，与表面修饰磁性粒子混合，在55-65℃下以100-150rpm的搅拌速度搅拌20-40min，调节ph至5.5-6，加入木瓜蛋白酶、甘露聚糖酶，搅拌3-3.5h，调节ph至8-9，加入碱性蛋白酶，搅拌2-2.5h，通过磁分离将表面修饰磁性粒子去除，并对表面修饰磁性粒子进行处理后回收，然后以9000-10000rpm的转速离心10-15min，弃去上清液，使用超纯水将沉淀清洗4-5次，置于60-70℃下烘干，得到粗葡聚糖；
5、所述酶解中，酵母细胞壁粉末、超纯水、表面修饰磁性粒子、木瓜蛋白酶、甘露聚糖酶、碱性蛋白酶的质量体积比为100-110g:1000-1200ml:1.2-1.5g:0.1-0.15g:0.2-0.25g:0.2-0.25g；
6、所述木瓜蛋白酶的酶活为80万iu/g；
7、所述甘露聚糖酶的酶活为50万iu/g；
8、所述碱性蛋白酶的酶活为50万iu/g；
9、所述表面修饰磁性粒子的制备方法，由以下步骤组成：制备磁性粒子，复合，表面修饰；
10、所述制备磁性粒子，将七水硫酸亚铁、六水氯化铁、超纯水混合后，在氮气的保护下，在75-85℃下以100-300rpm的搅拌速度搅拌30-40min，加入氨水，继续搅拌40-60min，加入柠檬酸的超纯水溶液，在90-95℃下以100-300rpm的搅拌速度搅拌1.5-2h，通过磁分离得到粗磁性粒子，使用超纯水清洗粗磁性粒子3-5次，置于60-70℃下烘干，得到磁性粒子；
11、所述制备磁性粒子，七水硫酸亚铁、六水氯化铁、超纯水、氨水、柠檬酸的超纯水溶液的质量体积比为80-110g:9.5-10g:200-250ml:20-25ml:15-20ml；
12、所述氨水的浓度为25wt%；
13、所述柠檬酸的超纯水溶液中柠檬酸的浓度为40-45wt%；
14、所述复合，将磁性粒子、第一份无水乙醇、乙腈、第一份氨水、钛酸四丁酯混合后，在室温下以100-300rpm的搅拌速度搅拌2-3h，通过磁分离得到一次包覆后的磁性粒子，使用无水乙醇清洗一次包覆后的磁性粒子2-3次，然后与第二份无水乙醇、超纯水、第二份氨水混合后，在190-210℃下水热反应12-15h，通过磁分离得到二次包覆后的磁性粒子，使用无水乙醇清洗二次包覆后的磁性粒子2-3次，置于60-70℃下烘干，得到复合磁性粒子；
15、所述复合中，磁性粒子、第一份无水乙醇、乙腈、第一份氨水、钛酸四丁酯、第二份无水乙醇、超纯水、第二份氨水的质量体积比为10-12g:1500-1800ml:800-900ml:90-120ml:17-20ml:800-1000ml:400-500ml:90-100ml；
16、所述氨水的浓度为25wt%；
17、所述表面修饰，将复合磁性粒子、无水乙醇、超纯水混合后，以20-25khz的频率超声振荡30-40min，加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌回流2-3h，通过磁分离得到一次包覆后的复合磁性粒子，然后将一次包覆后的复合磁性粒子与甲醇混合，以20-25khz的频率超声振荡2-2.5h，加入戊二醛，冰醋酸，在40-50℃下搅拌回流2-3h，加入壳聚糖的醋酸溶液，继续在40-50℃下搅拌回流3-4h，通过磁分离得到二次包覆后的复合磁性粒子，使用超纯水清洗二次包覆后的复合磁性粒子3-4次，置于60-70℃下烘干，得到表面修饰磁性粒子；
18、所述表面修饰中，复合磁性粒子、无水乙醇、超纯水、γ-氨丙基三乙氧基硅烷、甲醇、戊二醛、冰醋酸、壳聚糖的醋酸溶液的质量体积比为10-11g:800-900ml:150-200ml:0.65-0.7g:400-500ml:0.8-0.9g:0.08-0.1g:200-230ml；
19、所述壳聚糖的醋酸溶液的制备方法为：将1.9-2g壳聚糖、1.8-2g冰醋酸完全溶解于200-230ml超纯水中。
20、所述去杂，将粗葡聚糖加入150-200ml无水乙醇中，在室温下以50-100rpm的搅拌速度搅拌20-40min，以9000-10000rpm的转速离心10-15min，弃去上清液，将沉淀置于60-70℃下烘干，得到β-1,3-葡聚糖；
21、所述酶解中的酵母细胞壁粉末与去杂中的无水乙醇的质量体积比为100-110g:150-200ml；
22、前述制备方法制备的β-1,3-葡聚糖在生物诱导植物防病抗病中的应用，由以下步骤组成：混合，施用；
23、所述混合，将β-1,3-葡聚糖、多羟基纳米粒子悬浮液、四臂聚乙二醇羟基、水混合后，以20-25khz的频率超声振荡1-1.5h，得到混合悬浮液；
24、所述混合中，β-1,3-葡聚糖、多羟基纳米粒子悬浮液、四臂聚乙二醇羟基、水的质量体积比为20-25g:160-180ml:2-2.5g:1000-1300ml；
25、所述四臂聚乙二醇羟基的分子量为2000；
26、所述多羟基纳米粒子悬浮液的制备方法，由以下步骤组成：制备纳米羟基磷灰石，分散；
27、所述制备纳米羟基磷灰石，将葡萄糖、聚乙二醇400、氢氧化钠完全溶解于水中，得到混合液；将氯化钙水溶液与磷酸氢二铵水溶液混合均匀，调节ph至5.5-6，得到钙磷液；在10-15℃下对混合液以100-300rpm的搅拌速度搅拌，将混合液的ph调至10-10.5，然后将上述钙磷液滴加至上述混合液中，滴加过程中将混合液的ph稳定在10-10.5，待钙磷液滴加结束后，继续搅拌40-60min，在室温下静置20-25h，以11000-12000rpm的转速离心15-20min，弃去上清液，将沉淀置于80-90℃下烘干，得到纳米羟基磷灰石；
28、所述制备纳米羟基磷灰石中，葡萄糖、聚乙二醇400、氢氧化钠、水、氯化钙水溶液、磷酸氢二铵水溶液的质量体积比为40-45g:5-6g:10-15g:100-110ml:200-220ml:180-210ml；
29、所述氯化钙水溶液中氯化钙的浓度为1.1-1.2wt%；
30、所述磷酸氢二铵水溶液中磷酸氢二铵的浓度为0.8-0.85wt%；
31、所述钙磷液的滴加速度为5-6ml/min；
32、所述分散，将纳米羟基磷灰石、水混合后，以20-25khz的频率超声振荡40-50min，得到多羟基纳米粒子悬浮液；
33、所述分散中，纳米羟基磷灰石与水的质量体积比为20-25g:160-180ml；
34、所述施用，在植物出苗后将混合悬浮液通过喷淋的方式喷淋于植物叶片及根部。
35、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
36、（1）本发明的β-1,3-葡聚糖的制备方法及其在生物诱导植物防病抗病中的应用，在β-1,3-葡聚糖的制备中的酶解过程，使用了表面修饰磁性粒子，表面修饰磁性粒子为内核为磁性粒子，中间层为多孔二氧化钛纳米层，外层为多孔交联壳聚糖膜，在酶解过程中，外层、内核和中间层能够起到吸附和固定酶的作用，且对碱性蛋白酶的吸附作用大于对木瓜蛋白酶的吸附作用大于对甘露聚糖酶的吸附作用，因此，在加入木瓜蛋白酶和甘露聚糖酶后，外层、内核和中间层优先对木瓜蛋白酶进行吸附，利用交联壳聚糖膜能够与蛋白质之间形成氢键，从而对蛋白质产生吸附作用，吸附后的蛋白质能够与木瓜蛋白酶接触，在多孔二氧化钛与交联壳聚糖膜上发生酶解反应，从而提高了木瓜蛋白酶与蛋白质的接触面积，减少酶的无效吸附，从而避免由于酶的无效吸附带来的空间位阻的增大，从而提高了木瓜蛋白酶的酶解效率，在酶解过程中，随着搅拌的进行，不断发生氢键的断裂和形成，从而保证外层不断结合新的蛋白质与木瓜蛋白酶接触，即保证待酶解完成后，又重新结合新的蛋白质继续酶解，从而缩短了酶解时间，而大部分甘露聚糖酶存在于表面修饰磁性粒子外，与溶于水的甘露聚糖接触，从而实现对甘露聚糖的快速酶解；然后加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶继续吸附于外层、内核和中间层，通过壳聚糖的吸附蛋白作用，实现碱性蛋白酶对蛋白的快速酶解；从而通过木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的两重酶解，实现了对多种蛋白质的快速酶解，将木瓜蛋白酶和甘露聚糖酶混合，并利用外层、内核和中间层对不同酶的吸附能力的不同，避免将多种酶共同使用时，由于酶的无效吸附，导致酶被非目标物包围带来的酶解效率降低，从而提高了酶解效率，缩短了酶解时间；在β-1,3-葡聚糖的应用中加入了多羟基纳米粒子悬浮液和四臂聚乙二醇羟基，多羟基纳米粒子悬浮液为小粒径纳米羟基磷灰石的悬浮液，小粒径纳米羟基磷灰石表面分布有羟基，在将多羟基纳米粒子悬浮液和四臂聚乙二醇羟基与本发明制备的β-1,3-葡聚糖混合后进行超声振荡时，β-1,3-葡聚糖内的氢键发生部分断裂，断裂后的羟基会与小粒径纳米羟基磷灰石表面的羟基和四臂聚乙二醇羟基之间重新形成氢键，小粒径纳米羟基磷灰石的存在，能够提高植物对β-1,3-葡聚糖的吸收作用，四臂聚乙二醇羟基能够提高β-1,3-葡聚糖的水溶性，从而更有利于β-1,3-葡聚糖作用的发挥，且对β-1,3-葡聚糖的分子结构影响小；
37、（2）本发明的β-1,3-葡聚糖的制备方法，能够提高β-1,3-葡聚糖的得率和纯度，制备的β-1,3-葡聚糖的得率为17.5-19.3%，纯度为78.01-80.70wt%；
38、（3）本发明的β-1,3-葡聚糖的制备方法，能够缩短β-1,3-葡聚糖的制备时间，将制备的β-1,3-葡聚糖中的酶解总时间缩短至5-6h；
39、（4）本发明能够提高β-1,3-葡聚糖的水溶性，将本发明制备的β-1,3-葡聚糖、多羟基纳米粒子悬浮液、四臂聚乙二醇羟基、水混合后，超声振荡得到混合悬浮液，在以1000rpm的搅拌速度高速搅拌30min，未出现沉淀；
40、（5）本发明制备的β-1,3-葡聚糖，在生物诱导植物防病抗病中的应用中的应用效果好，在小麦防治麦锈病和白粉病的防病应用中能够将麦锈病的发生率降低至0.67-0.78%，将白粉病的发生率降低至0.78-0.94%，将产量提高至627-662kg/亩；在番茄对灰葡萄孢霉菌的拮抗应用中能够将番茄灰霉病的发病率降低至15-20%。
1.一种β-1,3-葡聚糖的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：酶解，去杂；
2.根据权利要求1所述的β-1,3-葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述酶解中，酵母细胞壁粉末、超纯水、表面修饰磁性粒子、木瓜蛋白酶、甘露聚糖酶、碱性蛋白酶的质量体积比为100-110g:1000-1200ml:1.2-1.5g:0.1-0.15g:0.2-0.25g:0.2-0.25g；
3.根据权利要求1所述的β-1,3-葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述制备磁性粒子，将七水硫酸亚铁、六水氯化铁、超纯水混合后，在氮气的保护下，在75-85℃下搅拌30-40min，加入氨水，继续搅拌40-60min，加入柠檬酸的超纯水溶液，在90-95℃下搅拌1.5-2h，得到粗磁性粒子，清洗、烘干粗磁性粒子，得到磁性粒子；
4.根据权利要求3所述的β-1,3-葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述复合，将磁性粒子、第一份无水乙醇、乙腈、第一份氨水、钛酸四丁酯混合后，在室温下搅拌2-3h后，得到一次包覆后的磁性粒子，对一次包覆后的磁性粒子进行清洗，然后与第二份无水乙醇、超纯水、第二份氨水混合后，在190-210℃下水热反应12-15h，得到二次包覆后的磁性粒子，对二次包覆后的磁性粒子进行清洗、烘干，得到复合磁性粒子；
5.根据权利要求4所述的β-1,3-葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述表面修饰，将复合磁性粒子、无水乙醇、超纯水混合后，超声振荡30-40min，加入γ-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌回流2-3h，得到一次包覆后的复合磁性粒子，然后将一次包覆后的复合磁性粒子与甲醇混合，超声振荡2-2.5h，加入戊二醛，冰醋酸，在40-50℃下搅拌回流2-3h，加入壳聚糖的醋酸溶液，继续在40-50℃下搅拌回流3-4h，得到二次包覆后的复合磁性粒子，清洗、烘干二次包覆后的复合磁性粒子，得到表面修饰磁性粒子；
6.根据权利要求1所述的β-1,3-葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述去杂，将粗葡聚糖加入150-200ml无水乙醇中，在室温下搅拌20-40min，离心，弃去上清液，烘干沉淀，得到β-1,3-葡聚糖；
7.一种由权利要求1-6任一项所述的制备方法制备的β-1,3-葡聚糖在生物诱导植物防病抗病中的应用，其特征在于，由以下步骤组成：混合，施用；
8.根据权利要求7所述的β-1,3-葡聚糖在生物诱导植物防病抗病中的应用，其特征在于，所述混合中，β-1,3-葡聚糖、多羟基纳米粒子悬浮液、四臂聚乙二醇羟基、水的质量体积比为20-25g:160-180ml:2-2.5g:1000-1300ml；
9.根据权利要求7所述的β-1,3-葡聚糖在生物诱导植物防病抗病中的应用，其特征在于，所述制备纳米羟基磷灰石，将葡萄糖、聚乙二醇400、氢氧化钠完全溶解于水中，得到混合液；将氯化钙水溶液与磷酸氢二铵水溶液混合均匀，调节ph至5.5-6，得到钙磷液；在10-15℃下对混合液搅拌，将混合液的ph调至10-10.5，然后将上述钙磷液滴加至上述混合液中，滴加过程中将混合液的ph稳定在10-10.5，待钙磷液滴加结束后，继续搅拌40-60min，在室温下静置20-25h，离心，弃去上清液，将沉淀烘干，得到纳米羟基磷灰石；
10.根据权利要求7所述的β-1,3-葡聚糖在生物诱导植物防病抗病中的应用，其特征在于，所述施用，在植物出苗后将混合悬浮液通过喷淋的方式喷淋于植物叶片及根部。
