本发明涉及通过至少两个不同的结合位点特异性结合冠状病毒的刺突蛋白并有效地中和冠状病毒(具体地沙贝病毒(sarbecovirus)，诸如sars-cov-1和sars-cov-2)的组合物和结合剂。这些组合物或制剂特异性结合该刺突蛋白的ace2受体结合结构域(rbd)的表位，其特征在于两个表位在沙贝病毒的多个进化枝中是保守的，提供了广泛中和的基于泛特异性抗体的组合物，从而减少病毒逃逸。这些制剂和组合物的应用和用途是本发明的另一部分。
背景技术：
1、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)是covid-19的病原体。sars-cov-2感染可以是无症状的，并且大多数表现为轻度至中度严重的症状。然而，在大约10％的患者中，covid-19发展到以呼吸困难和低氧血症为特征的更严重阶段，其可能进一步发展为急性呼吸窘迫，通常需要长期重症监护并导致部分患者死亡。“长期covid”还指covid-19感染的长期影响，即使不再能检测到sars-cov-2病毒。最有可能的是，由sars-cov-2病毒的先天识别触发的持续炎症，以及可能还由具有无效免疫应答产生的抗体的免疫复合物引发的持续炎症，导致严重的疾病进展。抑制或甚至阻止下呼吸道中(进一步)病毒复制的治疗选择可能会在拯救感染或再次感染covid-19的患者(老年人或其他患者)中发挥重要作用。一种特定类型的治疗方法可能依赖于中和抗体，即依赖于被动抗体疗法/免疫疗法(由于下呼吸道的炎症，免疫球蛋白从体循环进入支气管肺泡空间的流出增加，因此中和抗体的全身给药是可行的)。rujas等人，2020(doi:https://doi.org/10.1101/2020.10.15.341636)提供了结合sars-cov-2的刺突蛋白(s)的抗体的良好概述，其中在蛋白数据库(pdb)或电子显微镜数据库(emdb)中可获得这些抗体的条目，并提供了一些新的抗体，其中一些(抗体46和52)具有稍微偏离受体结合基序并可能使刺突蛋白不稳定的结合位点。
2、与sars-cov-1引起的严重急性呼吸综合征病毒(sars)相似，sars-cov-2使用血管紧张素转化酶2(ace2)作为进入人细胞的受体。sars-cov-2以比sars-cov-1更高的亲和力结合ace2。针对sars-cov的s结构域的抗体与sars-cov-2的交叉反应性描述于bates等人，2021(cell rep 34:108737)。
3、与人ace2受体相互作用的冠状病毒刺突蛋白的受体结合基序(rbm)提供了免疫原性区以供开发中和人抗体，尽管它也是引起sars-cov-2变体突变的热点之一，如由许多正在传播的sars-cov-2变体(诸如在英国出现的b.1.1.7变体和在南非发现的501y.v2变体)所表明的，这些变体能够降低结合rbm区的一些单克隆抗体的中和效力，并且令人担忧的是，甚至降低人恢复期血浆的中和效力(leung等人，2021，euro surveill.26，2002106)。单克隆抗体卡西瑞单抗(casirivimab)和伊德维单抗(imdevimab)(再生元制药公司(regeneron))和巴尼韦单抗(bamlanivimab)(礼来公司(lilly))已于2020年11月9日获得美国fda的紧急使用授权。最近报道称，sars-cov-2变体b.1.351(南非；包括rbd k417n、e484k、n501y中的变体)和b.1.1.248(巴西；包括rbd k417t、e484k和n501y中的变体)对卡西瑞单抗部分耐药并对巴尼韦单抗完全耐药(hoffmann等人，2021，doi:https://doi.org/10.1101/2021.02.11.430787)，充分证明了需要额外的治疗选择。因此，fda于2021年4月16日撤销了巴尼韦单抗作为单一疗法的紧急使用授权。变体的出现迫切需要开发与表位结合的中和抗体，这些表位因人抗体应答而选择压力降低。为此，单结构域抗体是特别适合的。由于它们的小尺寸，一些单结构域抗体可到达刺突中常规抗体更难接近的位点。已经报道了sars-cov-1和sars-cov-2的单结构域抗体/纳米抗体形式的中和剂，诸如wrapp等人，2020(cell 184:1004-1015)所述的vhh72。降低病毒逃逸免疫力的机会的另一种方法是将不同的vhh合并到双互补位构建体中(图1，改编自saelens和schepens，2021，science 371(6530)，681-682)。例如，koenig等人(2021，science 371，eabe6230)表明，结合非重叠表位的两个中和vhh的串联重复大大降低了在体外选择逃逸中和的突变病毒的机会。wu等人，2021(biorxiv doi:https://doi.org/10.1101/2021.02.08.429275)报道了一系列sars-cov-2中和纳米抗体，声称双特异性纳米抗体形式在鼻内给药的情况下增加了效力。
4、为了减少突变冠状病毒逃脱中和的可能性，需要与几个表位区结合的泛特异性抗体，其提供了不易发生病毒突变的混合结合位点。
技术实现思路
1、本发明涉及能够通过至少两个在沙贝病毒中均保守的结合位点结合沙贝病毒刺突蛋白受体结合结构域(sprbd)的泛特异性结合剂。
2、在第一方面，本发明涉及包含一种或多种结合剂的组合物，该一种或多种结合剂特异性结合冠状病毒刺突蛋白rbd，其中该一种或多种结合剂包含与seq id no:1所定义的sars-cov-2刺突蛋白的氨基酸残基y369、f377和k378结合的一个或多个第一免疫球蛋白单可变结构域(isvd)，以及与seq id no:1所定义的sars-cov-2刺突蛋白的氨基酸t393、n394、v395或y396中的至少一个或多个结合的一个或多个第二isvd。事实上，所述第一和第二isvd的所述结合位点也可定义为结合剂或结合结构域分别与vhh72(wrap等人，2020；cell 184:1004-1015；pct/ep2021/052885)和vhh3.117(如本文以及ep21166835.5和pct/ep2022/052919所示)特异性相互作用所需的最小残基。所述第一和第二isvd的所述结合位点提供了双结合区，其中的每个结合区分别允许中和sars-cov-1和sars-cov-2病毒，并提供了在冠状病毒刺突蛋白的rbd结构域上的结合区，该结合区在沙贝病毒中是保守的，因此更不易于突变和从中和中逃逸。
3、本发明还涉及一种结合剂，该结合剂包含与如seq id no:1所示的sars-cov-2刺突蛋白的氨基酸残基y369、f377和k378结合的一个或多个第一isvd，以及与如seq id no:1所示的sars-cov-2刺突蛋白的残基t393、n394、v395或y396中的至少一个或多个结合的一个或多个第二isvd。
4、在另一方面，本发明涉及编码本发明的结合剂的分离的核酸分子，以及包含所述核酸分子的重组载体。
5、另一方面涉及药物组合物，该药物组合物包含如上文所述的根据本发明的组合物、结合剂、分离的核酸和/或重组载体，并且所述药物组合物任选地包含稀释剂、载剂或赋形剂。
6、本发明同样涉及用作药物的上述(药物)组合物、结合剂、分离的核酸和/或重组载体。本发明同样涉及用于受试者的预防性治疗的上述(药物)组合物、结合剂、分离的核酸和/或重组载体。本发明同样涉及用于治疗冠状病毒感染(更具体地沙贝病毒感染)、更具体地用于治疗sars-cov-1或sars-cov-2感染的上述(药物)组合物、结合剂、分离的核酸和/或重组载体。本发明同样涉及用于受试者的被动免疫的上述(药物)组合物、结合剂、分离的核酸和/或重组载体。
1.一种组合物，其包含一种或多种特异性结合冠状病毒刺突蛋白的制剂，其中一种或多种制剂包含与如seq id no:1所示的sars-cov-2刺突蛋白的氨基酸残基y369、f377和k378结合的一个或多个第一免疫球蛋白单可变结构域(isvd)，以及与如seq id no:1所示的sars-cov-2刺突蛋白的残基t393、n394、v395或y396中的至少一个或多个结合的一个或多个第二isvd。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一个或多个第二isvd允许刺突蛋白的血管紧张素转化酶2(ace2)-受体结合结构域(rbd)与ace2结合，当所述一个或多个第二isvd与所述rbd结合时。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中一个或多个第一isvd进一步与如seq id no:1所示的sars-cov-2刺突蛋白的氨基酸残基l368、s371、s375、t376、c379和/或y508中的至少一个或多个结合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个第二isvd进一步与氨基酸残基k462(或在一些沙贝病毒中为r462)、f464(或在一些沙贝病毒中为y464)、e465(或在一些沙贝病毒中为g465)或r466中的至少一种结合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个第二isvd进一步与如seq id no:1所示的sars-cov-2刺突蛋白的至少残基r357结合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个第二isvd与如seqid no:1所示的sars-cov-2刺突蛋白的氨基酸n394(或在一些沙贝病毒中为s394)、y396、f464、s514、e516和r355中的至少一个，或按优选级递增顺序与至少两个、至少三个或至少四个结合；并且任选地进一步与氨基酸r357(或在一些沙贝病毒中为k357)和/或k462(或在一些沙贝病毒中为r462)和/或e465(或在一些沙贝病毒中为g465)和/或r466和/或l518结合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个第二isvd诱导s1脱落。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个第一isvd包含seqid no:2-21、90和seq id no:95-98中任一序列所示的互补决定区(cdr)，其中所述cdr根据kabat、martin、maccallum、imgt、abm或chothia进行注释，或其中cdr1由seq id no:28-37或141-143中的任一序列定义，cdr2由seq id no:38-50、144或145中的任一序列定义，以及cdr3由seq id no:51-61或146中的任一序列定义。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个第二isvd包含seqid no:22-27或seq id no:85-87中任一序列所示的互补决定区(cdr)，其中所述cdr根据kabat、martin、maccallum、imgt、abm或chothia进行注释；或其中cdr1由seq id no:70或138定义，cdr2由seq id no:71或139定义，以及cdr3由seq id no:72或140定义；或其中cdr1由seq id no:62或63或131或132中的任一序列定义，cdr2由seq id no:64-67或133-134中的任一序列定义，以及cdr3由seq id no:68或69或135-137中的任一序列定义。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个第一isvd包含选自seq id no:2-21、90和seq id no:95-98序列组中的序列，或其具有至少90％同一性的功能性变体，其中非同一的氨基酸位于一个或多个fr中，或其人源化变体。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个第二isvd包含选自seq id no:22-27和seq id no:85-87序列组中的序列，或其具有至少90％同一性的功能性变体，其中所述非同一的氨基酸位于一个或多个fr中，或其人源化变体。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其包含至少一种与选自seq id no:2-21、90和seq id no:95-98组中的任何结合剂竞争与所述rbd结合的制剂，和/或包含至少一种与选自seq id no:22-27和seq id no:85-87组中的任何结合剂竞争与所述rbd结合的制剂。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其包含单一的制剂，其中所述制剂包含所述一个或多个第一isvd和所述一个或多个第二isvd。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述第一和第二isvd直接融合或通过接头融合。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述接头为短肽接头或fc尾或另一部分。
16.根据权利要求13或14中任一项所述的组合物，其中所述制剂包含igg fc用于融合所述第一isvd和所述第二isvd以形成双特异性抗体，其中所述双特异性抗体可以是二价或四价的，例如旋钮入孔vhh融合体、vhh-vhh-fc融合体或vhh-fc-vhh融合体。
17.根据权利要求12至15中任一项所述的组合物，其中所述制剂包含选自seq id no:76-84、seq id no:91-93、seq id no:118和seq id no:119-121组中的序列，或其具有至少90％同一性的功能性变体，或其任何一种的人源化变体；或其中所述制剂包含选自序列对组：seq id no:107和108、seq id no:109和110、seq id no:111和112、seq id no:113和114、seq id no:115和116、以及seq id no:113和117中的一对序列，或其具有至少90％同一性的功能性变体，或其任何一种的人源化变体。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的结合剂。
19.一种分离的核酸，其编码根据权利要求13至18中任一项所述的结合剂。
20.一种重组载体，其包含根据权利要求19所述的核酸。
21.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至17中任一项所述的组合物、根据权利要求18所述的结合剂、根据权利要求19所述的分离的核酸和/或根据权利要求20所述的重组载体。
22.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物、根据权利要求18所述的结合剂、根据权利要求19所述的分离的核酸、根据权利要求20所述的重组载体、或根据权利要求21所述的药物组合物，其用作药物。
23.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物、根据权利要求18所述的结合剂、根据权利要求19所述的分离的核酸、根据权利要求20所述的重组载体、或根据权利要求21所述的药物组合物，用于受试者的被动免疫。
24.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物、根据权利要求18所述的结合剂、根据权利要求19所述的分离的核酸、根据权利要求20所述的重组载体、或根据权利要求21所述的药物组合物，用于治疗冠状病毒感染，更具体地说，用于治疗沙贝病毒感染。
25.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物、根据权利要求18所述的结合剂、根据权利要求19所述的分离的核酸、根据权利要求20所述的重组载体、或根据权利要求21所述的药物组合物，用于治疗sars-cov-1或sars-cov-2感染。
