本发明涉及微生物肥料，尤其涉及一种利用l-丙氨酸发酵废弃菌液制备微生物菌剂的方法。
背景技术：
1、随着我国农业产业化的发展，肥料在农业发展中起着极其重要的作用。复合肥是目前用量最大的一种化学肥料，其养分含量高，溶解性好，能够为作物生长提供多种营养元素，增加作物产量；但其养分的比例较为固定，在不同类型的土壤、不同种类的作物上使用时，是不能满足所有的需求的。微生物菌肥是一种含有大量有益微生物细菌和真菌的肥料，这些微生物能够分解土壤中的有机残体，将植物不能吸收的物质转化为有效养分，供植物吸收利用。将微生物菌肥施入土壤后，其在土壤中迅速繁殖，会产生多种对作物有益的代谢产物，这些代谢产物可刺激或调控作物生长，使作物健壮，达到增产目的；此外，微生物菌肥为作物还提供了有机质、腐殖酸、氨基酸等有机营养，有利于作物糖分的积累，提高产品的含糖量，解决了偏施化肥所造成的“菜不香、果不甜”的难题。近年来，我国大力提倡化肥农药零增长，推进微生物菌肥部分替代化肥。
2、生物发酵法中，将产目标产物的菌种接种到培养基中进行发酵培养，发酵结束后，通过陶瓷膜过滤、自然沉降或絮凝沉降等方式将发酵液中细胞、菌体和其它大颗粒悬浮物分离出来，得到含有大量菌体蛋白的废弃菌液。该发酵废弃菌液中含有丰富的菌体蛋白等营养成分，现有技术中有报道将其用于制备肥料。一般是将废弃菌液水解制成氨基酸后，再与其它营养元素进行复配制成肥料，或者是将废弃菌液经处理后直接添加到微生物菌剂中混合使用。如cn104261947a中公开了将苏氨酸发酵废弃的菌体蛋白在酸性条件下水解，再加入金属离子制成氨基酸螯合物，再与其它物料混合制粒制备成肥料。然而上述方法存在以下缺点：需要在反应釜内进行，且水解过程中需要使用大量的酸和碱，不利于环保；此外，酸解蛋白得到的活性肽形态单一，生物活性有限，且水解得到的氨基酸多数构型发生变化，作物吸收利用率低、肥效不理想。cn108033847a中公开了将赤霉素菌渣发酵腐熟后与功能微生物菌剂混合制得复合微生物肥料，该方法中赤霉素菌渣发酵腐熟过程中存在营养成分流失严重、腐熟周期长，功能微生物菌种类别相对单一，影响复合微生物菌肥的功效等问题。现有技术中还未有将发酵废弃母液用于微生物菌剂制备的相关报道。
技术实现思路
1、基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种利用l-丙氨酸发酵废弃菌液制备微生物菌剂的方法，利用地衣芽孢杆菌处理l-丙氨酸发酵菌渣，并加入适于em菌生长的成分，形成适于em菌生长的培养基，接入em菌后进行发酵获得微生物菌剂。
2、本发明提出的一种利用l-丙氨酸发酵废弃菌液制备微生物菌剂的方法，包括以下步骤：
3、1）l-丙氨酸发酵液过滤所得含有菌体和蛋白的发酵废弃菌液梯度稀释后，将活化后的地衣芽孢杆菌依次转接到浓度呈梯度增加的发酵废弃菌液的稀释液中进行传代培养；
4、2）向发酵废弃菌液中接入传代培养后的地衣芽孢杆菌，32~37℃下培养48~96h，得到降解液，灭菌处理；
5、3）向降解液中加入无机盐和糖蜜作为培养基，将em菌接种到扩增培养基上，28~35℃下培养36~60h，即得微生物菌剂。
6、优选地，步骤1）中，所述发酵废弃菌液是将l-丙氨酸发酵液灭菌后通过过滤分离出菌体和大颗粒悬浮物，得到含菌体和蛋白的发酵废弃菌液；优选地，所述过滤采用静置过滤或陶瓷膜过滤。
7、优选地，步骤1）中，所述发酵废弃菌液的含水量为25~40%。
8、优选地，步骤1）中，将发酵废弃菌液稀释至原浓度的10~100%。
9、优选地，步骤1）中，连续传代培养至少3代；优选地，发酵温度为34~37℃，发酵时间为24~48h。
10、优选地，步骤2）中，按照0.5~2vt%的接种量接入地衣芽孢杆菌，35~37℃下培养48~72h，搅拌转速为200~300r/min。
11、优选地，步骤2）中，搅拌条件下，于60~80℃下升温灭活15~30min。
12、优选地，步骤3）中，所述无机盐包括硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸亚铁中的至少一种；优选地，以降解液为基准，加入占其重量0.05~0.1%的硫酸镁、0.1~0.3%的磷酸氢二钾、0.001~0.003%的硫酸亚铁。
13、优选地，步骤3）中，以降解液为基准，加入占其重量3~5%的糖蜜。
14、优选地，步骤3）中，以0.5~1.5vt%的接种量将em菌接种到扩增培养基上，于30~32℃下培养36~48h，即制得微生物菌剂；优选地，所述em菌为土壤用em菌。
15、本发明中，所采用的em菌包括芽孢杆菌、酵母菌、光合细菌、放线菌、乳酸菌，各菌种的含量分别为(1.8-2.0)×108cfu/g、(5.5-5.8)×107cfu/g、(1.8-1.9)×107cfu/g、(4.5-4.7)×106cfu/g、(5.4-5.6)×106cfu/g。
16、本发明中，采用发酵法生产l-丙氨酸，需要通过陶瓷膜过滤、自然沉降或絮凝沉降等方式将l-丙氨酸发酵液中细胞、菌体和其它大颗粒悬浮物分离出来，得到含有大量菌体蛋白的发酵废弃废液。地衣芽孢杆菌具有较强的蛋白酶活性，可降解蛋白，还能够破坏细胞壁使细胞中的营养物质流出，因此，采用地衣芽孢杆菌对废弃菌渣降解，将其降解为小分子有机物质，有助于em菌的吸收利用；且利用稀释后的废弃菌液对地衣芽孢杆菌传代培养，提高地衣芽孢杆菌在废弃菌液中的适应性生长。
17、由于l-丙氨酸发酵废弃菌渣易染杂菌产生异味，且杂菌及地衣芽孢杆菌的存在还会影响em菌前期生长繁殖，通过灭菌来杀灭菌渣降解物，降低其对后续em菌生长繁殖的影响，且避免菌渣对环境造成二次污染。
18、经降解后的菌渣中含有丰富的营养成分，再向其中补入少量的无机盐和糖蜜，即能够保证em菌的正常生长繁殖；且在发酵过程中会产生酒精等物质，解决高浓度废弃菌液放置过程中产生的异味的问题，改善微生物菌剂的气味。
19、与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
20、1.发酵废弃菌液中含有丰富的蛋白质、氨基酸及其它营养物质，可作为微生物培养基的主要成分。本发明通过采用稀释后的废弃菌液对地衣芽孢杆菌进行适应性培养后，再利用其对l-丙氨酸发酵废弃菌液进行降解处理，将废弃菌液降解为小分子有机物质，有助于em菌的吸收利用。
21、2.本发明利用地衣芽孢杆菌处理l-丙氨酸发酵菌渣，并加入适于em生长的成分，形成适于em菌生长的培养基，接入em菌后进行发酵获得微生物菌剂；该微生物菌剂可以促进作物生长发育，提高作物产量和品质。本发明降低发酵生产线副产物废弃菌渣的处理成本，又实现了资源化利用。
1.一种利用l-丙氨酸发酵废弃菌液制备微生物菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的利用l-丙氨酸发酵废弃菌液制备微生物菌剂的方法，其特征在于，步骤1）中，所述发酵废弃菌液是将l-丙氨酸发酵液灭菌后通过过滤分离出菌体和大颗粒悬浮物，得到含菌体和蛋白的发酵废弃菌液；优选地，所述过滤采用静置过滤或陶瓷膜过滤。
3.根据权利要求1或2所述的利用l-丙氨酸发酵废弃菌液制备微生物菌剂的方法，其特征在于，步骤1）中，所述发酵废弃菌液的含水量为25~40%。
4.根据权利要求1-3任一项所述的利用l-丙氨酸发酵废弃菌液制备微生物菌剂的方法，其特征在于，步骤1）中，将发酵废弃菌液稀释至原浓度的10~100%。
5.根据权利要求1-4任一项所述的利用l-丙氨酸发酵废弃菌液制备微生物菌剂的方法，其特征在于，步骤1）中，连续传代培养至少3代；优选地，发酵温度为34~37℃，发酵时间为24~48h。
6.根据权利要求1-5任一项所述的利用l-丙氨酸发酵废弃菌液制备微生物菌剂的方法，其特征在于，步骤2）中，按照0.5~2vt%的接种量接入地衣芽孢杆菌，35~37℃下培养48~72h，搅拌转速为200~300r/min。
7.根据权利要求1-6任一项所述的利用l-丙氨酸发酵废弃菌液制备微生物菌剂的方法，其特征在于，步骤2）中，搅拌条件下，于60~80℃下升温灭活15~30min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的利用l-丙氨酸发酵废弃菌液制备微生物菌剂的方法，其特征在于，步骤3）中，所述无机盐包括硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸亚铁中的至少一种；优选地，以降解液为基准，加入占其重量0.05~0.1%的硫酸镁、0.1~0.3%的磷酸氢二钾、0.001~0.003%的硫酸亚铁。
9.根据权利要求1-8任一项所述的利用l-丙氨酸发酵废弃菌液制备微生物菌剂的方法，其特征在于，步骤3）中，以降解液为基准，加入占其重量3~5%的糖蜜。
10.根据权利要求1-9任一项所述的利用l-丙氨酸发酵废弃菌液制备微生物菌剂的方法，其特征在于，步骤3）中，以0.5~1.5vt%的接种量将em菌接种到扩增培养基上，于30~32℃下培养36~60h，即制得微生物菌剂；优选地，所述em菌为土壤用em菌。
