本发明属于基因工程与蛋白改造，具体内容涉及一种葡萄糖苷酶突变体及其应用。
背景技术：
1、β-葡萄糖苷酶(β-d-glucosidase,ec 3.2.1.21)，属于水解酶类，又称β-d-葡萄糖苷水解酶(β-d-glucoside glucohydrolase)，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它能够特异性水解含有结合在非还原性末端的β-d-葡萄糖苷键的寡糖和糖配基类似物，同时释放出相应的配基和β-d-葡萄糖。1837年liebig和wohler首次在苦杏仁汁中发现了该酶，它在自然界中分布广泛，在植物和微生物中尤为普遍，在动物和真菌体内也有该酶的存在。
2、多数β-葡萄糖苷酶都能够同时水解多种糖苷键，β-葡萄糖苷酶在众多的底物中对纤维二糖或对硝基苯-β-d-葡萄糖苷都有着最好的水解能力，可广泛应用于降苦脱苦、食品风味剂、水解大豆异黄酮以及合成活性糖苷化合物等领域中。陶宁萍等研究发现，β-葡萄糖苷酶可以把苦杏仁苷降解为苯甲醛、氢氰酸和两分子葡萄糖，进而使青梅的苦味大大降低。gueguen等人用外源β-葡萄糖苷酶直接处理酒精含量15％(v/v)葡萄酒后，用gc-ms分析香气成分的变化，结果发现，酶处理样和对照相比，苯甲醇、香叶醇、橙花醇、2-苯乙醇和芳香醇分别提高了1575％、1200％、600％、500％和155％。一般大豆异黄酮以结合型糖苷的形式存在，但研究发现该类物质不能直接被小肠吸收，不具有生物活性，必须利用β-葡萄糖苷酶的水解作用，释放出游离的苷元才能被人体吸收并发挥药理作用。大豆本身含有的内源性β-葡萄糖苷酶的水解效率不高，只有22％～29％，但l.malashree等研究发现，当补充足量的高活性β-葡萄糖苷酶后，其水解效率能提高到100％。在日用化工业方面，利用β-葡萄糖苷酶的转糖苷作用，可以合成非离子表面活性剂——烷基糖苷，具有低毒、高表面活性和易于被生物降解等特点。pernilla等从中纯化出β-葡萄糖苷酶b，在含16％(v/v)水的水/己醇两相系统中，利用tn-bglb的转糖苷活性从pnpg中转移糖基合成己基糖苷。
3、β-葡萄糖苷酶除上述多方面应用外，在其他方面也起着重要作用。在生物能源利用方面，植物细胞壁中大量的纤维素可以被β-葡萄糖苷酶降解成葡萄糖，再进一步发酵成乙醇，作为可再生的绿色能源。β-葡萄糖苷酶在植物体中能起到一定的防御害虫的作用。β-葡萄糖苷酶也可用来生产天然色素，如栀子蓝色素就是β-葡萄糖苷酶以茜草科植物栀子为原料生物转化成的一种天然色素。
4、然而，将β-葡萄糖苷酶应用于植物提取物加工领域的研究还相对较少，急需开发具有高耐热性、高催化效率、低生产成本低的特点的β-葡萄糖苷酶。
技术实现思路
1、本发明为解决现有技术问题，提供了一种葡萄糖苷酶突变体，是在葡萄糖苷酶7759的基础上通过大量的突变筛选，最终获得耐热性得到显著提高的葡萄糖苷酶突变体，为其在植物提取物加工领域的广泛使用奠定了基础。
2、本发明一方面提供了一种葡萄糖苷酶突变体，是氨基酸序列为seq id no:1的葡萄糖苷酶的第93位氨基酸由ala变为trp。
3、上述葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列为seq id no:3，其一种编码基因的核酸序列为seq id no:4。
4、本发明一方面提供了一种葡萄糖苷酶突变体，是氨基酸序列为seq id no:1的葡萄糖苷酶的第163位氨基酸由ile变为his。
5、上述葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列为seq id no:5，其一种编码基因的核酸序列为seq id no:6。
6、本发明一方面提供了一种葡萄糖苷酶突变体，是氨基酸序列为seq id no:1的葡萄糖苷酶的第258位氨基酸由ser变为met。
7、上述葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列为seq id no:7，其一种编码基因的核酸序列为seq id no:8。
8、本发明一方面提供了一种葡萄糖苷酶突变体，是氨基酸序列为seq id no:1的葡萄糖苷酶的第93位氨基酸由ala变为trp，第163位氨基酸由ile变为his，第258位氨基酸由ser变为met。
9、上述葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列为seq id no:9，其一种编码基因的核酸序列为seq id no:10。
10、本发明还包括携带有编码葡萄糖苷酶突变体基因的重组质粒。
11、本发明还提供了一种宿主细胞，包含上述重组质粒。
12、所述宿主细胞为黑曲霉(aspergillus niger)。
13、本发明以葡萄糖苷酶7759为基础，提供了分别包含a93w、i163h、s258m单点突变和包含a93w/i163h/s258m三点突变组合的葡萄糖苷酶突变体。与野生型葡萄糖苷酶7759相比，本发明提供的葡萄糖苷酶突变体的耐热性得到显著提升。60℃处理30min后，野生型葡萄糖苷酶7759的酶活残留率仅剩28％，而所述单点突变体的酶活残留提高了28.57％～60.71％，所述三点突变体的酶活残留率提高了182.14％，取得了意料不到的效果。所述突变体可用于水解芦丁生产槲皮素，能大大提高槲皮素的转化效率，反应4h时，槲皮素的转化率高达96.3％，效果非常显著。
14、本发明提供的耐热性提高的葡萄糖苷酶突变体可广泛用于植物提取物加工领域，应用前景广阔。
1.一种葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述的突变体是氨基酸序列为seq id no:1的葡萄糖苷酶的第93位氨基酸由ala变为trp。
2.一种葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述的突变体是氨基酸序列为seq id no:1的葡萄糖苷酶的第163位氨基酸由ile变为his。
3.一种葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述的突变体是氨基酸序列为seq id no:1的葡萄糖苷酶的第258位氨基酸由ser变为met。
4.一种葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述的突变体是氨基酸序列为seq id no:1的葡萄糖苷酶的第93位氨基酸由ala变为trp，第163位氨基酸由ile变为his，和第258位氨基酸由ser变为met。
5.编码权利要求1-4任一所述葡萄糖苷酶突变体的基因。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为seq id no:4或seqid no:6或seq id no:8或seq id no:10。
7.包含权利要求5或6所述基因的重组表达质粒。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求7所述的重组表达质粒；所述的宿主细胞为非植物细胞。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为黑曲霉(aspergillusniger)。
10.权利要求1-4任一所述葡萄糖苷酶突变体在植物提取物制备中的应用。
