本发明属于生物，具体涉及一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统及其制备方法和应用。
背景技术：
1、信使rna(messengerrna，mrna)，是由dna的一条模板转录而来，其携带着编码目标蛋白的遗传信息，随即在核糖体作用下翻译出功能性的蛋白。通过向细胞内递送外源性的mrna，并翻译出所需要的功能性蛋白，mrna技术已成为一类新兴的治疗手段，展示出巨大的潜力。然而，单独的mrna在生物环境中表现出极大的不稳定性和免疫原性，并且由于其带负电荷的性质而难以跨越同样带负电荷的细胞膜。因此，需要开发出一种强有力的递送系统来保护mrna，减缓它的降解，并使其成功递送到细胞质内最终翻译出目标蛋白而发挥作用。
2、当前针对mrna的递送开发出来的新材料主要集中在脂质纳米粒子(lipidnanoparticles，lnps)，通常其主要包含可电离脂质分子、胆固醇脂质类分子、辅助性磷脂分子、以及聚乙二醇化脂质分子。其中可电离脂质分子带正电，在酸性缓存液中通过静电相互作用与带负电的mrna分子形成复合物，并有助于mrna分子在细胞中的内涵体逃逸；胆固醇脂质类分子用来填充脂质之间的空隙，增加纳米粒子的稳定性；辅助性磷脂分子可以调节纳米粒子的膜流动性以改善其最终的性能；聚乙二醇化脂质分子用来减少纳米粒子与体内生物大分子的相互作用，增加纳米粒子的血液循环和半衰期。然而，当前基于lnps的mrna递送系统仍然存在以下几个主要问题：(1)lnps的组分比较复杂，除去功能性的mrna组分以外，至少需要含有其他4种组分，而每种组分对mrna的最终递送效果都有决定性的影响，因此通常在研发lnps递送系统时，需要花费大量财力物力和人力去优化lnps的配方。(2)lnps组分中各类脂质分子，比如胆固醇、磷脂等，分子量相对较小，流动性更强，因此所制备的lnps的整体结构的稳定性不高，使得其在体内血液循环中的半衰期相对较短，最终难以发挥预期的作用。(3)lnps中的核心组分——可离子化脂质，以及辅助磷脂分子等脂质结构的合成、生产放大的难度相对较大。
3、因此，目前仍然急需开发一类新型的、关键组分更少的、结构更加稳定的mrna递送系统，进而使mrna的翻译表达性能更好，最终推动mrna技术的应用和发展。
技术实现思路
1、本发明的目的在于公开了一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统(lipid-polymerhybridnanoparticles，lpnps)。
2、本发明的第二个目的在于公开了上述递送系统的制备方法。
3、本发明的第三个目的在于公开了上述递送系统的应用。
4、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
5、第一方面，本发明提供了一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统(mrna-lpnps递送系统)。
6、一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其中：所述递送系统的组分包括mrna、阳离子分子、聚合物和修饰性两亲性分子；其中，阳离子分子与负电荷的mrna通过静电相互作用形成复合物；聚合物用来容纳阳离子分子-mrna复合物，三者形成稳定的内核结构；修饰性两亲性分子通过疏水相互作用锚定在内核结构的表面，形成类球形的核-壳结构。
7、上述技术方案所述的mrna聚合物-脂质杂化递送系统中的mrna，理论上可以是任意一种mrna，示例性地包括但不限于：自报告基因mrna、基因组编辑mrna、抗原mrna、抑癌基因mrna、白细胞介素mrna或、细胞嵌合抗原受体mrna或其他功能性mrna。
8、上述技术方案所述的mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其中：所述自报告基因mrna包括但不限于gfp、egfp、fluc、mcherry、betagal或renillaluc；
9、所述基因组编辑mrna包括但不限于cas9、cas9nickase或cre重组酶；
10、所述抗原mrna包括但不限于ova；
11、所述抑癌基因mrna包括但不限于p53或pten；
12、所述白细胞介素mrna包括但不限于il-10、il-12或il-6。
13、上述技术方案所述的mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其中：所述阳离子分子，示例性地包括但不限于：氨分子衍生物、铵盐及其衍生物、带正电荷两亲性类脂化合物、聚酰胺及其衍生物、聚乙烯亚胺及其衍生物。
14、图39为上述阳离子分子中几种有代表性的阳离子分子：恒带正电的阳离子脂质(例如dotap、dotma、dmrie等)、不饱和双键可电离脂质(例如dlin-mc3-dma等)、多尾可电离脂质(例如c12-200等)、聚合物类可电离脂质(例如聚酰胺树枝状大分子pamam，聚乙烯亚胺pei等)。
15、上述技术方案所述的mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其中：所述的聚合物，示例性地包括但不限于：脂肪族聚酯类高分子及其衍生物，例如聚乳酸、聚己内脂、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等；聚碳酸脂及其衍生物；聚多糖及其衍生物；聚氨基酸及其衍生物；聚合物多元醇及其衍生物、聚丙烯酸及其衍生物。图40为上述聚合物分子中几种有代表性的聚合物：
16、上述技术方案所述的mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其中：所述的修饰性两亲性分子，示例性地包括但不限于：聚乙二醇化两亲性分子，例如dspe-peg、dmg-peg、f127等；两亲性表面活性剂，例如co-520等；两亲性蛋白质，例如白蛋白；以及其他修饰性分子，例如甘露醇、改性壳聚糖、葡聚糖、羧基葡聚糖、正硅酸乙酯、聚丙烯酸、kh560、kh550、二乙烯三胺五乙酸、葡甲胺、精氨酸、聚谷氨酸、多肽等。图41为上述修饰性两亲性分子中几种有代表性的分子：
17、第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的mrna-lpnps递送系统的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
18、(a)制备阳离子分子溶液；
19、(b)mrna和阳离子分子形成静电复合物；
20、(c)上述所形成的mrna/阳离子分子复合物中依次加入聚合物和修饰性两亲性分子；
21、(d)通过自组装法得到稳定封装mrna的纳米粒子——mrna聚合物-脂质杂化递送系统；
22、上述技术方案所述的mrna-lpnps递送系统制备方法，其中具体步骤为：
23、(a1)将阳离子分子溶于溶剂中，制备浓度为0.5～5.0mg/ml含有阳离子分子的溶液；
24、所述阳离子分子包括但不限于氨分子衍生物、铵盐及其衍生物、带正电荷两亲性类脂化合物、聚酰胺及其衍生物、聚乙烯亚胺及其衍生物中的至少一种；
25、所述溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙二醇、二乙二醇、dmf、苯甲醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷中的至少一种；
26、(b1)将含有mrna的溶液与含有阳离子分子的溶液混合均匀，反应一段时间后，得到mrna/阳离子分子静电络合物；
27、反应时间为5s～30min、反应的温度为0℃～37℃；
28、所述含有mrna的溶液中mrna的浓度为0.1～10mg/ml；
29、所述mrna与阳离子分子的质量比为1:1～1:100；
30、所述的mrna，理论上可以是任意一种mrna，示例性地包括但不限于：自报告基因mrna、基因组编辑mrna、抗原mrna、抑癌基因mrna、白细胞介素mrna或、细胞嵌合抗原受体mrna或其他功能性mrna；
31、所述自报告基因mrna包括但不限于gfp、egfp、fluc、mcherry、betagal或renillaluc中的一种；
32、所述基因组编辑mrna包括但不限于cas9、cas9nickase或cre重组酶中的一种；
33、所述抗原mrna包括但不限于ova；
34、所述抑癌基因mrna包括但不限于p53或pten中的一种；
35、所述白细胞介素mrna包括但不限于il-10、il-12或il-6中的一种；
36、(c1)将上述mrna/阳离子分子静电络合物与聚合物溶液混合均匀；
37、反应时间为5s～30min、反应的温度为0℃～37℃；
38、所述含有聚合物分子的溶液中聚合物分子的浓度为0.1～20mg/ml；
39、上述所述的聚合物分子包括但不限于以下聚合物中的至少一种：脂肪族聚酯类高分子及其衍生物，例如聚乳酸、聚己内脂、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等；聚碳酸脂及其衍生物；聚多糖及其衍生物；聚氨基酸及其衍生物；聚合物多元醇及其衍生物、聚丙烯酸及其衍生物；
40、(d1)向上述mrna/阳离子分子/聚合物混合溶液中继续加入修饰性两亲性分子溶液，混合均匀；
41、所述修饰性两亲性分子溶液中修饰性两亲性分子的浓度为0.1～20mg/ml；
42、所述的修饰性两亲性分子包括但不限于以下分子中的至少一种：聚乙二醇化两亲性分子，例如dspe-peg、dmg-peg、f127等；两亲性表面活性剂，例如co-520等；两亲性蛋白质，例如白蛋白；以及其他修饰性分子，例如甘露醇、改性壳聚糖、葡聚糖、羧基葡聚糖、正硅酸乙酯、聚丙烯酸、kh560、kh550、二乙烯三胺五乙酸、葡甲胺、精氨酸、聚谷氨酸、多肽等；
43、(e1)mrna/阳离子分子/聚合物/修饰性两亲性分子混合液加入到酸性水相溶液中，反应一段时间后，得到所述mrna-lpnps纳米递送系统粒子；
44、酸性溶液的ph范围为1～6；
45、反应时间为30s～30min、反应的温度为0℃～37℃；
46、所述酸性缓冲溶液包括但不限于柠檬酸/柠檬酸盐、醋酸/醋酸盐、盐酸/盐酸盐、硫酸/硫酸盐、硝酸/硝酸盐中的至少一种；
47、在步骤(b1)、(c1)、(d1)和(e1)中，所述溶液混合方式包括包括但不限于以下方式中的至少一种：滴加、搅拌、静置、微流控设备、蠕动泵、微量注射泵等。
48、上述技术方案所述的mrna-lpnps递送系统制备方法，其中：所述制备方法为微流控制备，包括步骤(a1)、(b1)和(c1)；
49、(d1)向步骤(c1)制备得到的mrna/阳离子分子/聚合物混合溶液中继续加入修饰性两亲性分子溶液，混合均匀得到dmf有机相；
50、(e1)制备水相溶液；
51、(f1)在微流控条件下，dmf有机相流速：1～5ml/min，水相溶液流速：5～25ml/min，制备mrnalpnps。
52、上述技术方案所述制备方法制备所得一种mrna-lpnps递送系统。
53、上述技术方案所述的一种mrna-lpnps递送系统，其中：mrna-lpnps递送系统中mrna的包封率≥50％，较佳地≥60％，更佳地≥70％，更佳地≥80％，更佳地≥90％，最佳地≥95％(如99％)。
54、上述技术方案所述的一种mrna-lpnps递送系统，其中：mrna-lpnps递送系统中mrna与其递送系统中其它分子的质量比为1:100～10:1。
55、上述技术方案所述的一种mrna-lpnps递送系统，其中：所述mrna-lpnps递送系统为二维、三维或层状结构；纳米递送系统粒子为以mrna-阳离子分子-聚合物为核心，修饰性两亲性分子包覆在外为壳形成的三维纳米复合材料；纳米递送系统粒子的粒径为10nm～500nm，较佳地为20-250nm，更佳地为30-200nm，更佳地为70-130nm，更佳地为100-125nm，最佳地为110-125nm。
56、上述技术方案所述的一种mrna-lpnps递送系统，其中：mrna-lpnps递送系统按所述递送系统的总个数计，80％(较佳地85％，更佳地90％，更佳地95％，最佳地≥99％)的所述递送系统材料的粒径位于±15％(较佳地±10％，更佳地±1％)的所述纳米复合材料的d50范围内。
57、上述技术方案所述的一种mrna-lpnps递送系统，其中：所述mrna-lpnps递送系统在水溶液以及0.9％的生理盐水中可稳定分散。
58、上述技术方案所述的一种mrna-lpnps递送系统，其中：所述mrna-lpnps递送系统在水或0.9％的生理盐水中，在4℃、25℃、37℃、-20℃、-80℃下，保存5-20天时，较佳地20-40天时，更佳地40-60天时，纳米递送系统粒子的平均粒径变化≤20％，较佳地≤10％，更佳地≤5％，最佳地≤3％。
59、上述技术方案所述的一种mrna-lpnps递送系统，其中：mrna-lpnps递送系统中的mrna的细胞转染效率≥50％，较佳地≥60％，更佳地≥70％，更佳地≥80％，更佳地≥90％，最佳地≥95％(如99％)。
60、第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的mrna-lpnps递送系统的应用，其中：所述应用为在制备肿瘤治疗药物中的应用、在制备肿瘤疫苗中的应用、在制备肿瘤靶向药物中的应用、在制备体内外诊断肿瘤材料中的应用、在制备炎症相关疾病治疗中的应用、在制备传染疾病治疗中的应用、在制备传染疾病预防中的应用、在制备伤口愈合治疗中的应用、在制备心脑血管慢行疾病治疗中的应用、在制备器官纤维化治疗中的应用、在制备病毒感染治疗中的应用、在制备病毒感染预防中的应用、在制备体内外基因编辑治疗中的应用、在制备非酒精性脂肪肝治疗中的应用、在制备肠道疾病治疗中的应用、在制备新抗原疫苗中的应用、在制备细胞诱导分化中的应用、在制备蛋白美容中的应用、在制备蛋白缺陷类疾病治疗中的应用、在制备衰老修复中的应用、在制备抗衰老中的应用或在制备药物载体中的应用。
61、本技术方案根据所递送的mrna的功能不同，最终所得mrna-lpnps递送系统的应用也相应不同。
62、第四方面，本发明提供了一种含有上述任一技术方案中所述的mrna-lpnps递送系统的制品。
63、本发明具有以下有益效果：
64、1、本发明所提供的用于递送mrna的聚合物-脂质杂化递送系统成分包括mrna、阳离子分子、聚合物和修饰性两亲性分子。由于分子量更大的聚合物的引入，降低了纳米粒子内部的流动性，稳定了mrna-阳离子分子复合物，从而在减少mrna递送系统关键组分的同时，实现了更高的mrna转染效率。
65、2、本发明所提供的mrna-lpnps递送系统制备方法，是通过逐步自组装方法得到一系列的具有优异mrna转染能力的纳米材料，该纳米材料粒径合适、稳定性好、水分散性好、生物相容性优异、结构稳定、材料组分少、mrna转染效率高、材料原料生产简便且廉价。
66、3、本发明所提供的mrna-lpnps递送系统制备方法，具有环境友好、安全可靠、工艺简单、成本低廉且产率高、质量易于控制、易于大规模生产等优势。
67、4、本发明所提供的mrna-lpnps递送系统，具有高的mrna包封率，可以保护mrna结构，降低mrna的酶促降解速率，减少免疫原性。
68、5、本发明所提供的mrna-lpnps递送系统，可以提高mrna对温度储存的适应性：mrna-lpnps递送系统纳米材料相比于单纯的mrna可在4℃、25℃、37℃、-20℃、-80℃保存更久。
69、6、本发明所提供的mrna-lpnps递送系统相较于传统lnps递送系统，由于分子量更大的聚合物的引入，增加了整体结构的稳定性，因此可以减少递送系统的组分，降低原材料规模化生产难度和成本，为高效递送mrna提供新的平台。
1.一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：所述递送系统的组分包括mrna、阳离子分子、聚合物和修饰性两亲性分子；其中，阳离子分子与负电荷的mrna通过静电相互作用形成复合物；聚合物用来容纳阳离子分子-mrna复合物，三者形成稳定的内核结构；修饰性两亲性分子通过疏水相互作用锚定在内核结构的表面，形成类球形的核-壳结构。
2.根据权利要求1所述的mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：所述的mrna选自以下mrna中的至少一种：自报告基因mrna、基因组编辑mrna、抗原mrna、抑癌基因mrna、白细胞介素mrna或、细胞嵌合抗原受体mrna或其他功能性mrna。
3.根据权利要求2所述的mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：所述阳离子分子选自氨分子衍生物、铵盐及其衍生物、带正电荷两亲性类脂化合物、聚酰胺及其衍生物、聚乙烯亚胺及其衍生物中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：所述的聚合物选自以下聚合物中的至少一种：脂肪族聚酯类高分子及其衍生物、聚碳酸脂及其衍生物、聚多糖及其衍生物、聚氨基酸及其衍生物、聚合物多元醇及其衍生物、聚丙烯酸及其衍生物。
6.根据权利要求5所述的mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：所述脂肪族聚酯类高分子及其衍生物选自聚乳酸、聚己内脂、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种。
7.根据权利要求1所述的mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：所述的修饰性两亲性分子选自以下分子中的至少一种：聚乙二醇化两亲性分子、两亲性表面活性剂、两亲性蛋白质或其他修饰性分子。
8.根据权利要求7所述的mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：
9.一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统的制备方法，包括下述步骤：
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：步骤(c1)中所述脂肪族聚酯类高分子及其衍生物选自聚乳酸、聚己内脂、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：步骤(d1)中所述聚乙二醇化两亲性分子选自dspe-peg、dmg-peg、f127中的一种；
13.根据权利要求10～12中任一权利要求所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法为微流控制备，包括步骤(a1)、(b1)和(c1)；
14.权利要求9～13中任一权利要求所述制备方法制备所得的一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统。
15.权利要求1～8或权利要求14中任一权利要求所述的一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：mrna-lpnps递送系统中mrna的包封率≥50％，较佳地≥60％，更佳地≥70％，更佳地≥80％，更佳地≥90％，最佳地≥95％。
16.权利要求1～8或权利要求14中任一权利要求所述的一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：mrna-lpnps递送系统中mrna与其递送系统中其它分子的质量比为1:100～10:1。
17.权利要求1～8或权利要求14中任一权利要求所述的一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：所述mrna-lpnps递送系统为二维、三维或层状结构；纳米递送系统粒子为以mrna-阳离子分子-聚合物为核心，修饰性两亲性分子包覆在外为壳形成的三维纳米复合材料；纳米递送系统粒子的粒径为10nm～500nm，较佳地为20-250nm，更佳地为30-200nm，更佳地为70-130nm，更佳地为100-125nm，最佳地为110-125nm。
18.权利要求1～8或权利要求14中任一权利要求所述的一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：mrna-lpnps递送系统按所述递送系统的总个数计，80％、较佳地85％、更佳地90％、更佳地95％、最佳地≥99％的所述递送系统材料的粒径位于±15％、较佳地±10％、更佳地±1％的所述纳米复合材料的d50范围内。
19.权利要求1～8或权利要求14中任一权利要求所述的一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：所述mrna-lpnps递送系统在水溶液以及0.9％的生理盐水中可稳定分散。
20.权利要求1～8或权利要求14中任一权利要求所述的一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：所述mrna-lpnps递送系统在水或0.9％的生理盐水中，在4℃、25℃、37℃、-20℃、-80℃下，保存5-20天时，较佳地20-40天时，更佳地40-60天时，纳米递送系统粒子的平均粒径变化≤20％、较佳地≤10％、更佳地≤5％、最佳地≤3％。
21.权利要求1～8或权利要求14中任一权利要求所述的一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统，其特征在于：mrna-lpnps递送系统中的mrna的细胞转染效率≥50％、较佳地≥60％、更佳地≥70％、更佳地≥80％、更佳地≥90％、最佳地≥95％。
22.权利要求1～8或权利要求14中任一权利要求所述的一种mrna聚合物-脂质杂化递送系统的应用，其特征在于：所述应用为在制备肿瘤治疗药物中的应用、在制备肿瘤疫苗中的应用、在制备肿瘤靶向药物中的应用、在制备体内外诊断肿瘤材料中的应用、在制备炎症相关疾病治疗中的应用、在制备传染疾病治疗中的应用、在制备传染疾病预防中的应用、在制备伤口愈合治疗中的应用、在制备心脑血管慢行疾病治疗中的应用、在制备器官纤维化治疗中的应用、在制备病毒感染治疗中的应用、在制备病毒感染预防中的应用、在制备体内外基因编辑治疗中的应用、在制备非酒精性脂肪肝治疗中的应用、在制备肠道疾病治疗中的应用、在制备新抗原疫苗中的应用、在制备细胞诱导分化中的应用、在制备蛋白美容中的应用、在制备蛋白缺陷类疾病治疗中的应用、在制备衰老修复中的应用、在制备抗衰老中的应用或在制备药物载体中的应用。
23.一种含有权利要求1～8或权利要求14中任一权利要求所述的mrna聚合物-脂质杂化递送系统的制品。
