陆生棘壳孢霉的检测引物、探针、试剂盒及其应用

专利检索2025-08-08  7


本发明属于生物,具体地说,涉及陆生棘壳孢霉的检测引物、探针、试剂盒及其应用。


背景技术:

1、陆生棘壳孢霉setophoma terrestris(h.n.hansen)gruyter(中文异名:洋葱粉色根腐病菌,拉丁异名pyrenochaeta terrestris、phoma terrestris),隶属真菌界fungi、子囊菌门ascomycota、座囊菌纲dothideomycetes、格孢腔菌目pleosporales、暗壳腔菌科phaeosphaeriaceae、棘壳孢霉属setophoma,是重要的植物病原真菌,可侵染葱属(包括但不限于洋葱、蒜、韭葱),燕麦、芸薹属、黄苞肖竹芋、笋瓜、南瓜、紫花苜蓿、水稻、棉豆、豌豆、番茄、小麦、豇豆、玉米等多种植物,对农作物种植生产造成很大威胁。目前在塞内加尔、加拿大、美国、日本有相关植物病害发生的报道,中国仅有局部地区发生危害的报道。鉴于病害的严重危害程度,该病原菌被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。区分和鉴定陆生棘壳孢霉对口岸检疫人员和我国农业生产人员来说不仅任务繁重,而且是一个很大的挑战。有害生物入侵的超前预警、快速检测、风险分析和科学控制是防范外来物种的核心内容,其中,有害生物鉴定是其中的首要环节。对陆生棘壳孢霉进行有效识别,对于控制其危害,及时阻断其传播、扩散,起着至关重要的作用。目前,我国对检疫性陆生棘壳孢霉鉴定的主要流程是菌株分离、形态观察、序列测定和分析,但是这样的操作远远不能满足口岸和农业生产部门对于有害病原菌高效、精准的检出要求。

2、当前,随着各国贸易往来日益密切,各种农产品、商品流通日渐增多,该病菌传入我国及在我国定殖的可能性很大,而目前国内外尚无与此病菌检疫鉴定方法相关的技术法规、标准和专利制定,因此制定陆生棘壳孢霉检疫鉴定方法具有极大迫切性和实用性。为满足检验检疫工作的需要,更好地把好国门,防止有害生物入侵,有效地开展日常检测工作,建立病原菌陆生棘壳孢霉的特异、灵敏、快速和有效的分子检测方法在实践和应用研究中是十分必要的。本专利根据陆生棘壳孢霉的分子生物学特征及实时荧光pcr原理,应用所设计引物和探针对陆生棘壳孢霉进行检测鉴定。在检疫口岸,能够对含有陆生棘壳孢霉的样品进行快速准确筛查,防止病菌随种子及其它繁殖材料进出口、调运而传播蔓延,以保护我国农业生产的健康发展,具有重要的意义。


技术实现思路

1、本发明的目的是提供陆生棘壳孢霉的检测引物、探针、试剂盒及其应用。

2、为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供一种陆生棘壳孢霉(setophomaterrestris)的pcr检测引物,包括:

3、正向引物its-lf:5'-ttggtgttgggcgtcttgtc-3'(seq id no:1)

4、反向引物its-lr:5'-tccgaggtcaaacgtggtaaatg-3'(seq id no:2)

5、第二方面,本发明提供陆生棘壳孢霉(setophoma terrestris)的检测探针,其为:

6、探针se-mgb1:5'-actcgccttaaattcattggcagc-3'(seq id no:3);

7、且在所述探针的一个末端标记有荧光报告基团,另一个末端标记有荧光淬灭基团。

8、优选地,所述探针的5'末端标记有荧光报告基团,3'末端标记有荧光淬灭基团。

9、在本发明的一个具体实施方式中,所述探针的5'端标记荧光报告基团fam,3'端标记荧光淬灭基团mgb。

10、第三方面,本发明提供一种含有所述引物its-lf/its-lr,和/或所述探针se-mgb1的检测试剂或试剂盒。

11、第四方面,本发明提供陆生棘壳孢霉(setophoma terrestris)实时荧光pcr检测试剂盒,包含所述引物its-lf/its-lr和所述探针se-mgb1。

12、进一步地,所述试剂盒还包括dntps、pcr反应缓冲液、mg2+、dna聚合酶、阳性模板等中的至少一种。

13、第五方面,本发明提供所述引物its-lf/its-lr、所述探针se-mgb1或含有所述引物和/或所述探针的检测试剂或试剂盒在检测陆生棘壳孢霉中的应用。

14、第六方面,本发明提供陆生棘壳孢霉的pcr检测方法,以待测样本的dna为模板,利用所述引物its-lf/its-lr进行pcr扩增,检测pcr扩增产物;如果扩增产物出现约143bp大小的特征条带(seq id no:4)则待测样本含有或疑似含有陆生棘壳孢霉。

15、第七方面,本发明提供陆生棘壳孢霉的实时荧光pcr检测方法,以待测样本的dna为模板,利用所述引物its-lf/its-lr和所述探针se-mgb1进行实时荧光pcr扩增,检测荧光信号;如果荧光信号显示符合阳性扩增曲线,则待测样本含有或疑似含有陆生棘壳孢霉。

16、进一步地,实时荧光pcr扩增的反应体系中,所述正向引物、反向引物的最佳浓度均为0.4μm,所述探针的最佳浓度为0.6μm。

17、优选地,实时荧光pcr扩增的反应条件为:50℃30min;95℃15min;94℃15s,60℃1min,共40个循环。

18、所述待测样本可为植物样品、真菌纯培养样品、土壤样品等。

19、优选地,所述植物样本可为叶片、茎秆、根、果实等。

20、本发明针对现有技术中依赖形态学检测和测序对陆生棘壳孢霉进行鉴定的方法存在的技术问题(费时、繁琐、专业性要求高等缺点),根据陆生棘壳孢霉物种的遗传学和分子生物学特征,开发了陆生棘壳孢霉特异性靶序列以及其特异性引物对和探针,利用开发的特异性引物对和探针对陆生棘壳孢霉进行检测鉴定,进而提供了一种操作简单、快速、灵敏、准确的鉴定陆生棘壳孢霉的方法。与现有技术相比,本发明至少具有下列优点及有益效果:

21、(一)检测过程快速简单:本发明提供的检测方法仅需少量dna样品,利用荧光pcr仪仅需1小时就可完成pcr扩增,直接得到检测结果;

22、(二)特异性强:本发明提供的针对陆生棘壳孢霉的特异性引物对具有高度的特异性,能够高效进行目标基因片段的扩增,可与本发明提供的特异性荧光探针配合进行检测,有效地避免假阳性和假阴性;

23、(三)灵敏度高:本发明提供的针对陆生棘壳孢霉的特异性引物对具有优异的扩增效率,与本发明提供的特异性荧光探针配合,能够显著提高检测的灵敏度;

24、(四)交叉污染低:本发明提供的荧光定量pcr检测方法的整个检测过程完全闭管,不需pcr后处理,消除了pcr产物的污染;

25、(五)本发明提供的荧光定量pcr检测方法可以实现陆生棘壳孢霉的定量检测。

26、(六)本发明提供的靶序列、特异性引物对和探针以及检测方法,在检疫口岸,能够对含有陆生棘壳孢霉的样品进行快速准确筛查,防止病菌随种子及其它繁殖材料进出口、调运而传播蔓延,对于植物病原性陆生棘壳孢霉的检测、防控以及促进农业生产的健康发展具有重要的意义,具有重大的应用推广价值。


技术特征:

1.陆生棘壳孢霉(setophoma terrestris)的pcr检测引物,其特征在于,包括:

2.陆生棘壳孢霉(setophoma terrestris)的检测探针,其特征在于,其为:

3.含有权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针的检测试剂或试剂盒。

4.陆生棘壳孢霉(setophoma terrestris)实时荧光pcr检测试剂盒,其特征在于,包含权利要求1所述引物和权利要求2所述探针。

5.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括dntps、pcr反应缓冲液、mg2+、dna聚合酶、阳性模板中的至少一种。

6.权利要求1所述引物、权利要求2所述探针或权利要求3-5任一项所述试剂盒在检测陆生棘壳孢霉中的应用。

7.陆生棘壳孢霉(setophoma terrestris)的pcr检测方法,其特征在于,以待测样本的dna为模板,利用权利要求1所述引物进行pcr扩增,检测pcr扩增产物;如果扩增产物出现143bp大小的特征条带,则待测样本含有或疑似含有陆生棘壳孢霉。

8.陆生棘壳孢霉(setophoma terrestris)的实时荧光pcr检测方法,其特征在于,以待测样本的dna为模板,利用权利要求4或5所述试剂盒中的引物和探针进行实时荧光pcr扩增,检测荧光信号;如果荧光信号显示符合阳性扩增曲线,则待测样本含有或疑似含有陆生棘壳孢霉。

9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,实时荧光pcr扩增的反应体系中,所述正向引物、反向引物的浓度均为0.4μm,所述探针的浓度为0.6μm;

10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述待测样本为植物样品、真菌纯培养样品或土壤样品;


技术总结
本发明公开了陆生棘壳孢霉的检测引物、探针、试剂盒及其应用。本发明根据陆生棘壳孢霉物种的遗传学和分子生物学特征,开发了陆生棘壳孢霉特异性靶序列以及其特异性引物对和探针,利用开发的特异性引物对和探针对陆生棘壳孢霉进行检测鉴定,进而提供一种操作简单、快速、灵敏、准确的鉴定陆生棘壳孢霉的方法。本发明提供的靶序列、特异性引物对和探针以及检测方法,在检疫口岸,能够对含有陆生棘壳孢霉的样品进行快速准确筛查,防止病菌随种子及其它繁殖材料进出口、调运而传播蔓延,对于植物病原性陆生棘壳孢霉的检测、防控以及促进农业生产的健康发展具有重要的意义,具有重大的应用推广价值。

技术研发人员:蔡磊,刘芳,段维军,普布多吉
受保护的技术使用者:中国科学院微生物研究所
技术研发日:
技术公布日:2024/5/29
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