本发明涉及一种合成角鲨烯的解脂亚洛酵母菌株及其应用，属于基因工程及生物工程。
背景技术：
1、角鲨烯(squalene)是一种高价值无环三萜化合物。在人体中，角鲨烯在肝脏中合成，由皮脂腺分泌，角鲨烯是皮脂和表面脂质的主要成分之一。角鲨烯在化妆品行业被认为是优良的润肤剂和抗氧化成分，它能够渗透到皮肤深层，减缓真皮层水分流失，从而抵消细纹和干燥斑块的出现，因此角鲨烯还用于治疗皮肤病，包括痤疮、牛皮癣、干燥相关的皮肤病变、脂溢性皮炎和特应性皮炎。大量研究表明，经常食用角鲨烯可能会抑制肿瘤细胞的增殖，这可能是机体角鲨烯合成途径受到反馈抑制，减少蛋白质的异戊二烯化。此外，由于角鲨烯具有亲脂性和优异的表面张力，它已被用作配制药物递送和疫苗佐剂。由于角鲨烯在医药、食品、化妆品等行业的广泛应用，对于它的需求也与日俱增，虽然角鲨烯在动、植物中普遍存在，但由于动物提取在许多地区违反动物保护条例，而植物提取的过程繁琐且产率低。目前利用微生物进行角鲨烯的高效生产成为更有优势的生产方法。
2、真核生物中具有角鲨烯合成的天然途径，经过中心代谢产生的乙酰辅酶a是角鲨烯合成的重要前体。在真核生物中，乙酰辅酶a经过甲羟戊酸(mva)途径转化为五碳化合物ipp和dmapp，ipp和dmapp在法呢基二磷酸合酶(erg20)和角鲨烯合酶(erg9)的催化下最终生成角鲨烯，这一系列催化过程还需要atp和nadph的参与。原核生物中也存在与mva途径类似的1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸(dxp)途径，但dxp途径通常不产生角鲨烯，以原核生物为宿主，需要借助合成生物学手段，构建角鲨烯合成途径。目前，已实现利用代谢工程策略改造微生物高效生成角鲨烯，但这是基于对酿酒酵母的代谢改造所达成的，在商业化生产情况下，需要高浓度乙醇作为基础碳源，这会为生产过增加许多安全隐患。解脂亚洛酵母是一种crabtree阴性酵母，具有底物谱广、乙酰辅酶a池充足、脂质含量丰富、适应高密度发酵等特点。特别地，解脂亚洛酵母中的过氧化物酶体是脂质聚集的天然疏水性区室，且其中存在的脂肪酸β-氧化途径是产生乙酰辅酶a的重要代谢过程。解脂亚洛酵母的过氧化物酶体可以成为角鲨烯生产适宜的细胞区室。
技术实现思路
1、本发明提供了一种合成角鲨烯的解脂亚洛酵母工程菌，以解脂亚洛酵母po1f为出发菌株，进行了如下至少一种改进：
2、(1)在基因组上多拷贝位点整合角鲨烯合成关键基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶thmg1、ipp异构酶idi1、角鲨烯环氧化酶erg9、甲羟戊酸激酶erg12、法呢基二磷酸合酶erg20；
3、(2)将角鲨烯合成途径引入过氧化物酶体；
4、(3)表达酮脂酰基coa硫解酶pot1、酰基辅酶a氧化酶pox1和atp-柠檬酸裂解酶acl1，强化前体乙酰辅酶a。
5、在一种实施方式中，所述将角鲨烯合成途径引入过氧化物酶体，具体是在角鲨烯合成途径的关键酶的c端融合过氧化物酶体信号肽skl或crmvgkskl。
6、在一种实施方式中，所述出发菌株为解脂亚洛酵母po1f，公开于论文《combining26s rdna and the cre-loxp system for iterative gene integration and efficientmarker curation in yarrowia lipolytica》。
7、在一种实施方式中，所述多拷贝整合位点zeta和26s rdna均为已公开的位点，公开于论文《a new recombinant protein expression system for high-throughputscreening in the yeast yarrowia lipolytica》和《combining 26s rdna and the cre-loxp system for iterative gene integration and efficient marker curation inyarrowia lipolytica》。
8、在一种实施方式中，所述解脂亚洛酵母以解脂亚洛酵母po1f，解脂亚洛酵母e129，解脂亚洛酵母e150，解脂亚洛酵母po1d，解脂亚洛酵母po1g或解脂亚洛酵母po1h为出发菌株。
9、在一种实施方式中，所述解脂亚洛酵母内源基因thmg1、idi1、erg9、erg12、erg20整合在基因组zeta位点上。
10、在一种实施方式中，所述解脂亚洛酵母内源基因thmg1、idi1、erg9整合在基因组26srdna位点上。
11、在一种实施方式中，所述thmg1、idi1、erg9、erg12和erg20整合在基因组上的拷贝数≥3。
12、在一种实施方式中，所述过氧化物酶体信号肽skl的核苷酸序列添加至erg10、erg13、thmg1、erg12、erg8、erg19、idi1、erg20、erg9的3’端，使基因编码的蛋白的c端融合有信号肽skl并整合至基因组上。
13、在一种实施方式中，所述过氧化物酶体信号肽crmvgkskl的核苷酸序列添加至erg10、erg13、thmg1、erg12、erg8、erg19、idi1、erg20、erg9的3’端，使上述基因编码的蛋白的c端融合有信号肽crmvgkskl并整合至基因组上。
14、在一种实施方式中，所述过氧化物酶体信号肽skl的核苷酸序列添加至idi1、erg9和erg20的3’端，使基因编码的蛋白的c端融合有信号肽skl并整合至基因组d17位点上。
15、在一种实施方式中，所述过氧化物酶体信号肽crmvgkskl的核苷酸序列添加至idi1、erg9和erg20的3’端，使基因编码的蛋白的c端融合有信号肽skl并整合至基因组d17位点上。
16、在一种实施方式中，所述过氧化物酶体信号肽skl的核苷酸序列添加至erg8、erg12、erg19的3’端，使基因编码的蛋白的c端融合有信号肽skl并整合至基因组e3位点上。
17、在一种实施方式中，所述过氧化物酶体信号肽crmvgkskl的核苷酸序列添加至erg8、erg12、erg19的3’端，使基因编码的蛋白的c端融合有信号肽skl并整合至基因组e3位点上。
18、在一种实施方式中，所述过氧化物酶体信号肽skl的核苷酸序列添加至erg10、erg13、thmg1的3’端，使上述基因编码的蛋白的c端融合有信号肽skl并整合至基因组c2位点上。
19、在一种实施方式中，所述过氧化物酶体信号肽crmvgkskl的核苷酸序列添加至erg10、erg13、thmg1的3’端，使上述基因编码的蛋白的c端融合有信号肽crmvgkskl并整合至基因组c2位点上。
20、在一种实施方式中，所述基因pox1和pot1整合至基因组上f1-3位点上。
21、在一种实施方式中，所述基因acl1整合至基因组上axp位点上。
22、在一种实施方式中，所述过氧化物酶体信号肽skl的核苷酸序列为tccaagctg；过氧化物酶体信号肽crmvgkskl的核苷酸序列如seq id no.1所示。
23、在一种实施方式中，所述基因pot1具有gene id:2912002所示的核苷酸序列；所述基因pox1具有gene id:2912003所示的核苷酸序列。
24、本发明还提供了所述解脂亚洛酵母工程菌在生产角鲨烯中的应用。
25、在一种实施方式中，将培养至对数生长期的解脂亚洛酵母工程菌菌液接种至ypd培养基中，接种后od达到0.6-0.8，在28～30℃、200～220rpm下发酵培养。
26、在一种实施方式中，用于种子培养的培养基为ypd培养基，含有：酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖40g/l，ph值自然。
27、在一种实施方式中，将培养至对数生长期的菌液接种至ypd培养基中，接种后od达到0.6-0.8，在28～30℃、200～220rpm下发酵培养。
28、在一种实施方式中，所述发酵是在5l以上规模的发酵罐上进行，发酵时间≥144h。
29、在一种实施方式中，发酵过程还进行补料；所述补料是补加葡萄糖，使发酵体系中的葡萄糖浓度为0.1～1g/l。
30、在一种实施方式中，发酵过程添加特比萘芬；所述添加方法是向培养至对数生长期的发酵菌液中添加特比萘芬，使发酵体系中的特比萘芬浓度为1～2g/l。
31、本发明还要求保护所述解脂亚洛酵母工程菌，或角鲨烯生产的方法，或利用解脂亚洛酵母合成角鲨烯的方法在食品、医药、化工领域生产方面的应用。
32、有益效果：本发明以解脂亚洛酵母po1f为宿主，通过过表达角鲨烯合成关键基因thmg1、idi1、erg9、erg12、erg20，构建了具有高效的角鲨烯合成能力的解脂亚洛酵母。并利用过氧化物酶体信号肽skl、crmvgkskl，将角鲨烯合成途径引入过氧化物酶体，进一步提高了解脂亚洛酵母合成角鲨烯的能力。然后，通过强化胞质和过氧化物酶体中前体乙酰辅酶a的供给，最终构建角鲨烯高效生产菌株，在摇瓶产量达到2549.1±37.3mg/l，5l发酵罐发酵产量达到51.2±0.4g/l。本发明将在过氧化物酶体中构建角鲨烯合成途径，并通过多拷贝整合，强化胞质中角鲨烯合成途径，实现了角鲨烯的高产，为后续的低成本合成角鲨烯奠定了基础。
1.一种合成角鲨烯的解脂亚洛酵母工程菌，其特征在于，在出发菌株的基础上，具有如下至少一种改进：
2.根据权利要求1所述的解脂亚洛酵母工程菌，其特征在于，所述将角鲨烯合成途径引入过氧化物酶体是在角鲨烯合成途径的关键酶的c端融合过氧化物酶体信号肽skl或crmvgkskl。
3.根据权利要求2所述的解脂亚洛酵母工程菌，其特征在于，将所述过氧化物酶体信号肽skl的核苷酸序列添加至erg10、erg13、thmg1、erg12、erg8、erg19、idi1、erg20和/或erg9的3’端，使基因编码的蛋白的c端融合有信号肽skl并整合至基因组上；
4.根据权利要求1～3任一所述的解脂亚洛酵母工程菌，其特征在于，将解脂亚洛酵母内源基因thmg1、idi1、erg9、erg12、erg20整合在基因组zeta位点上；或
5.根据权利要求1～4任一所述的解脂亚洛酵母工程菌，其特征在于，所述出发菌株为解脂亚洛酵母po1f，解脂亚洛酵母e129，解脂亚洛酵母e150，解脂亚洛酵母po1d，解脂亚洛酵母po1g或解脂亚洛酵母po1h。
6.权利要求1～5任一所述解脂亚洛酵母工程菌在生产角鲨烯或含角鲨烯的产品中的应用。
7.一种发酵生产角鲨烯的方法，其特征在于，将权利要求1～5任一所述的解脂亚洛酵母工程菌在培养基中，于28～30℃、200～220rpm发酵培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵过程添加特比萘芬。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，发酵过程还进行补料；所述补料是补加葡萄糖，使发酵体系中的葡萄糖浓度为0.1～1g/l。
10.权利要求1～5任一所述的解脂亚洛酵母工程菌，或权利要求7～9任一所述的方法在食品、医药、化工领域生产方面的应用。
