本发明涉及微生物学领域，尤其涉及一种杀藻菌膜囊泡(membrane vesicles,mvs)的制备及其应用。
背景技术：
1、随着全球水体富营养化的加剧，有害藻华的爆发日趋频繁，其造成的环境和经济问题引起人们越来越多的关注。目前，已有多种技术被应用于有害藻华的治理，主要包括化学、物理和生物学方法。其中，化学和物理方法虽然在一定程度上可以有效去除藻细胞，但是成本较高，且容易造成二次污染。而溶藻微生物因其具有分布广泛、种类多、繁殖速度快及环境友好等特点而备受关注，成为最具潜力的生物控藻方式。许多研究表明，藻类和细菌之间具有错综复杂的互作关系，如互利共生、敌对拮抗或者竞争抑制等，这种复杂的菌藻关系在藻华的生消过程中发挥着重要的作用。因此，利用杀藻细菌来控制有害藻华是一种绿色高效的治理方法。
2、目前，已报道的溶藻细菌作用方式有两种：一是直接溶藻，即直接进攻目标藻，该过程需要细菌与藻细胞的直接接触；二是间接溶藻，即细菌与藻细胞竞争有限的营养物质或细菌通过分泌胞外杀藻活性物质诱导藻细胞的死亡。然而，这两种方法在实际应用中存在一定的局限性，例如：溶藻细菌在复杂的藻华爆发环境中可能无法正常生长或生长缓慢；此外，溶藻细菌分泌的杀藻活性物质也可能因海水稀释和扩散较快而难以达到有效浓度，或者受到环境中核酸酶、蛋白酶及水解酶等的攻击而降低或丧失杀藻活性；更为重要的是，这两种作用方式一般都具有较低的物种特异性，可能会导致无害藻类的减少，甚至生态环境的恶化。因此，亟需探索一种能够保护、浓缩杀藻活性物质并具有较高物种特异性的高效杀藻方式，使之有望应用于有害藻华治理的实践中。
3、细菌在正常生长过程中会释放直径为20至400nm的膜囊泡(mvs)，主要由外膜突起及爆炸性细胞裂解产生。细菌膜囊泡(bmvs)含有特定的生物活性分子，并介导多种生物学过程，包括毒力、营养获取、细菌竞争、应激反应、水平基因转移(hgt)、宿主生存和细胞间通信等。这些纳米颗粒最显著的特性是它们能将核酸、蛋白质、脂质、信号分子和金属离子等多种细菌产物以高浓度和受保护的方式输送到远处的细胞。因此bmvs不仅在自然界中含量丰富，并且已经广泛应用于疫苗开发、药物递送以及合成生物学和生物技术开发等方面，但尚无将bmvs应用于有害藻华治理的研究和案例。
4、综上，本发明提供了一种杀藻菌膜囊泡的制备方法并探究其在杀藻过程中的作用。制得的mvs可作为生物分子载体行使杀藻活性物质的递送和杀藻功能。一方面，bmvs可以将浓缩的杀藻活性物质靶向输送到目标藻；另一方面，bmvs的双层膜结构有利于保护其装载的杀藻活性物质免受外部核酸酶、蛋白酶及水解酶等的攻击；更为重要的是，bmvs可在海水中保持结构和杀藻活性的稳定，有望用于有害藻华的治理。
技术实现思路
1、本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种杀藻菌膜囊泡的制备及其应用。
2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、细菌分泌的生物颗粒，所述生物颗粒是从杀藻菌中分离的膜囊泡。
4、进一步，所述杀藻菌为革兰氏阴性菌。
5、进一步，所述革兰氏阴性菌为葱绿几丁质单胞菌(chitinimonasprasina ly03保藏号：1f01209)
6、进一步，所述葱绿几丁质单胞菌为需氧菌。
7、含有上述生物颗粒的杀藻菌。
8、进一步，所述杀藻菌与所述具有杀藻活性的生物颗粒组合。
9、本发明的目的还在于提供一种杀藻菌膜囊泡的制备方法，具体包括以下步骤：
10、1)将培养至稳定期的杀藻菌液高速离心并去沉淀收集上清液1；
11、2)将所述上清液1分别用孔隙直径为0.45μm及0.22μm的过滤器过滤得到上清液2；
12、3)将所述上清液2用100kda超滤管进行离心浓缩得到上清浓缩液；
13、4)将所述上清浓缩液用超速离心机离心，沉淀为粗提膜囊泡；
14、进一步，所述步骤1)中高速离心速率为10000g；离心时间为30min。
15、进一步，所述步骤3)中的离心速率为4000g；离心时间为5min。
16、进一步，所述步骤4)中的超速离心速率为150000g；离心时间为3h。
17、采用上述方法所得的粗提膜囊泡。
18、本发明的目的还在于提供一种杀藻菌膜囊泡的纯化方法。
19、一种纯化杀藻菌膜囊泡的方法，具体包括以下步骤：
20、1)用上述制备膜囊泡的方法进行制备，得粗提膜囊泡。
21、2)配置8种不同浓度的密度梯度离心液；
22、3)将所述8种不同浓度的密度梯度离心液按浓度从高到低的顺序依次加入超离管中并用超速离心机离心，得到8种分层样品；
23、4)将所述8种分层样品用pbs清洗一遍，超速离心并去除上清，其中4～6层样品所得沉淀为纯化的膜囊泡。
24、进一步，所述步骤1)中的粗提膜囊泡重悬于45％的密度梯度离心液中。
25、进一步，所述步骤2)中所用密度梯度离心液为optipreptm并含有10mm hepes-nacl。
26、优选的，步骤2)中所配置的密度梯度离心液浓度为：45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％。
27、进一步，所述步骤3)中超速离心速率为100000g；离心时间为6h。
28、进一步，所述步骤4)中超速离心速率为150000g；离心时间为1.5h。
29、优选的，步骤4)中4～6层样品所得沉淀经透射电镜观察，鉴定为膜囊泡。
30、采用上述方法所得的膜囊泡。
31、本发明的目的还在于提供杀藻菌膜囊泡的应用，上述膜囊泡在杀藻中的应用。
32、本发明制得的膜囊泡作为杀藻活性物质的载体参与杀藻过程的应用。
33、进一步，所述膜囊泡具有较高的杀藻活性，并在杀藻过程中行使货物递送的功能。
34、相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：
35、本发明首次分离并纯化一种杀藻菌分泌的mvs，所得膜囊泡的纯度较高；此外，不添加抗生素及其他化学刺激物质，避免了刺激物残留及刺激物本身对膜囊泡导致的不良作用。制备的膜囊泡具有较高的杀藻活性，并作为生物分子载体行使杀藻活性物质的递送和杀藻功能，有望应用于有害藻华的治理。
1.一种杀藻菌膜囊泡的制备，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种杀藻菌膜囊泡的制备，其特征在于，步骤5)中所用密度梯度离心法，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的一种杀藻菌膜囊泡的制备，其特征在于：步骤1)中，配置8种不同浓度的密度梯度离心液。
4.如权利要求3所述的一种杀藻菌膜囊泡的制备，其特征在于：步骤1)中，配置8种不同浓度的密度梯度离心液，浓度为：45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％。
5.如权利要求1所述的一种杀藻菌膜囊泡的制备，其特征在于：所述杀藻菌为革兰氏阴性菌。
6.如权利要求5所述的一种杀藻菌膜囊泡的制备，其特征在于：所述革兰氏阴性菌为葱绿几丁质单胞菌。
7.如权利要求1所述的一种杀藻菌膜囊泡的制备，其特征在于：步骤2)中，两种过滤器的孔隙直径分别为0.45μm及0.22μm。
8.一种杀藻菌膜囊泡，其特征在于：采用权利要求1～7任一项所述的一种杀藻菌膜囊泡的制备方法所制备。
9.权利要求8所述的一种杀藻菌膜囊泡的应用，其特征在于：所述杀藻菌膜囊泡在杀藻中的应用。
10.如权利要求9所述的一种杀藻菌膜囊泡的应用，其特征在于：所述杀藻菌膜囊泡作为生物分子载体行使杀藻活性物质的递送和杀藻功能。
