本发明涉及生物，具体地说，是一种高效鉴定裸鼹鼠造血干细胞的方法。
背景技术：
1、造血干细胞代表了迄今为止研究最广泛的成体干细胞群体。成体的造血活性主要存在于骨髓中。然而，骨髓的细胞组成是极其异质的，包括不同的祖细胞群体，可以根据它们的自我更新和分化潜力进行分层组织。长期hsc(lt-hsc)是造血的基础支柱：它们无限自我更新的能力保证了生物体在整个生命中所需的血细胞的稳态和连续翻转。lt-hsc还可以产生短期hsc(st-hsc)，其广泛的增殖和分化有助于产生多能祖细胞(mmp)和所有下游祖细胞，最终将产生终末分化的血细胞。与静止的lt-hsc的亚群相反，高度增殖的st-hsc和mmps在移植时只能在短期内维持造血并迅速耗尽。因此研究造血稳态维持的规律对于造血移植和再生具有重要意义。然而，这一重要的基础就是，建立基于物种多样性的造血干细胞鉴定体系。
2、裸鼹鼠是长寿的啮齿类动物，寿命长达30年，但是其骨髓造血系统却始终不表现出衰老迹象。骨髓维持终生的造血功能，并且在机体免疫防御中发挥重要作用。但是关于裸鼹鼠造血干细胞的培养尚没有建立出可行的实验方法，主要原因在于：1)裸鼹鼠是一种变温动物，其体细胞离体培养的温度有待摸索，并且其不恒定的机体代谢速率导致其体细胞体外培养基区别于普通的大鼠或小鼠；2)裸鼹鼠生存在较为阴暗潮湿的环境中，其体细胞的培养对湿度有较高的要求；3)裸鼹鼠已经适应了外界低氧的环境，所以其体细胞离体培养环境中的氧气浓度区别于常氧环境中生活的动物，并且需要摸索；4)尚未筛选出有效的流式抗体对裸鼹鼠骨髓造血干细胞进行识别和标记。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种高效鉴定裸鼹鼠造血干细胞的方法，以方便、高效的获得纯度高、状态好的裸鼹鼠造血干细胞，为体外建立裸鼹鼠造血干细胞提供技术支持，同时为体外研究裸鼹鼠造血干细胞的分化、增殖以及低氧耐受能力、以及低氧耐受机制的阐述和相应治疗药物或靶分子的筛选提供强大的保障。
2、为了实现上述目的，本发明提供一种高效鉴定裸鼹鼠造血干细胞的方法，包括以下步骤：
3、(a)裸鼹鼠骨髓造血干细胞的收集：
4、用10ml注射器吸取5ml hbss溶液后连接针头(27号)，将骨髓从股骨中冲洗出来；
5、将细胞悬浮液转移到50ml锥形管中，并通过70μm细胞过滤器进行过滤，以从样品细胞团块或骨碎片中去除；随后300g离心5min收集细胞(约500μl)；
6、加入5倍(约1500μl)细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟；400-500g(4℃)离心5分钟，弃红色上清；
7、对骨髓细胞进行计数，一只裸鼹鼠(18月龄)平均会产生1.5-2×107个有核细胞；
8、(b)裸鼹鼠骨髓造血干细胞的鉴定：
9、lin-骨髓细胞富集：利用lin-抗体(fitc linked anti-human cd11b(≤0.25μg/106细胞/100μl体积)，fitc linked anti-cd18(≤1μg/106细胞/100μl体积)，fitc linkedanti-cd90(≤1μg/106细胞/100μl体积)，fitc conducted anti-cd125(≤1μg/106细胞/100μl体积)于4℃条件下孵育15min。添加10倍体积冰hbss溶液洗去未结合的抗体，4℃下于300g离心收集细胞并重悬于hbss缓冲液中。
10、使用apc anti-mouse cd34(≤1μg/106细胞/100μl体积)于4℃条件下孵育15min。添加10倍体积冰hbss溶液洗去未结合的抗体，4℃下于300g离心收集细胞并重悬于hbss缓冲液中。
11、使用pe anti-rat cd90/mouse cd90.1(thy-1.1)(≤1μg/106细胞/100μl体积)于4℃条件下孵育15min。添加10倍体积冰hbss溶液洗去未结合的抗体，4℃下于300g离心收集细胞并重悬于hbss缓冲液中。
12、使用7-aad(1μm)室温孵育5min，标记死细胞。
13、形态学特征设门。将第一个面板中门控的细胞显示为fsc(向前散射)和ssc(向后散射)并绘制第二个门。
14、lin-细胞的筛选：对fitc的激发，门控表达造血终末分化标志物的细胞并选择谱系阴性细胞。激发光波段488nm，收集光波段525nm。
15、apc+细胞的筛选：apc的激发，在lin-细胞中选择cd34+细胞。激发光波段638nm，收集光波段660nm。
16、pe+细胞筛选：pe的激发，在lin-细胞中选择thy-1.1int细胞。激发光波段561nm，收集光波段585nm。
17、7aad的激发：激发光采用546nm激发光和650nm发射光。
18、本发明优点在于：
19、1、综合使用多种抗体对从裸鼹鼠骨髓造血干细胞进行鉴定，操作方法简单，具有较高的可重复性。
20、2、在筛选测试多种抗体的基础上，确定了可以用于裸鼹鼠造血干细胞鉴定的抗体，便于在此基础上利用抗体对裸鼹鼠骨髓造血干细胞进行分离、培养及鉴定及相关研究的开展。
21、综上所述，本发明方法能够简便、高效、便捷的鉴定裸鼹鼠造血干细胞，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。
1.一种高效鉴定裸鼹鼠造血干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
