本发明涉及医药制备，具体涉及一种马来酰亚胺-peg与dna-sh的连接的改进方法。
背景技术：
1、wang等在顶级期刊nature chemistry上发表的论文中马来酰亚胺-peg与抗体的巯基发生反应(nature chemistry,2019,11,310)，实验步骤为抗体与约5equiv的tcep在37℃pbs缓冲液中反应2小时，然后抗体与20equiv的马来酰亚胺-peg在4℃搅拌12h。我们参照文献方法进行马来酰亚胺-peg与dna-sh的连接。通过凝胶电泳实验结果分析，马来酰亚胺-peg与dna-sh的连接效率低，产物收率低。
2、此外，参照gothelf在bioconjugate chemistry上发表的论文中马来酰亚胺-dna与peg-sh的反应条件(bioconjugate chemistry,2022,33,1254)：马来酰亚胺-dna与peg-sh在hepes缓冲液(ph 7.5,50mm,100mm nacl)室温下过夜反应。开展了马来酰亚胺-peg与dna-sh的反应。凝胶电泳结果显示马来酰亚胺-peg与dna-sh的产物条带基本不可见。
3、因此，应用文献中的马来酰亚胺和巯基修饰的生物大分子之间的连接方法，开展马来酰亚胺-peg与dna-sh的连接实验，并没有得到高产率的连接产物。针对这一问题，我们改进实验方法：首先用三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)还原dna-sh；然后，去除dna-sh中的tcep；最后，用新还原的dna-sh和马来酰亚胺-peg在cb缓冲体系中进行反应。该实验的创新点在乙醇沉降dna去除tcep，去除tcep极大地提高了马来酰亚胺-peg和dna-sh的连接产物的收率。
技术实现思路
1、针对上述马来酰亚胺-peg与dna-sh的连接方法，其存在连接效率低，产物收率低的技术问题，本发明提供一种马来酰亚胺-peg与dna-sh的连接的改进方法，本发明的方法首先用tcep还原dna-sh；然后，去除dna-sh中的tcep；最后，用新还原的dna-sh和马来酰亚胺-peg在cb缓冲体系中进行反应。该实验的创新点在乙醇沉降dna去除tcep，去除tcep极大地提高了马来酰亚胺-peg和dna-sh的连接产物的收率。
2、为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
3、本发明提供一种马来酰亚胺-peg与dna-sh的连接的改进方法，通过以tcep还原dna-sh；然后，去除aso中的tcep；最后，用新还原的dna-sh和马来酰亚胺-peg在cb缓冲体系中进行反应，得到马来酰亚胺-peg与dna-sh的连接物。
4、一种马来酰亚胺-peg与dna-sh的连接的改进方法，具体步骤如下：
5、1)dna-sh还原：dna-sh和tcep于室温下进行反应，制得dna-sh还原物；
6、2)除tcep：将步骤1)中制得的dna-sh还原物，加入naac缓冲溶液，涡旋，再加入预冷的无水乙醇，于-20℃冷冻，离心，弃去上清液，加入预冷的85％的乙醇，离心，弃去上清液，洗涤，制得除tcep的产物；
7、3)dna-sh和马来酰亚胺-peg连接反应：将步骤2)中制得的产物，与ho-p1 k-mal或dspe-p1 k-mal，在28℃-45℃水浴锅中过夜反应21-24小时，制得终产品。
8、步骤1)中所述的dna-sh从冰箱取出后需离心，加入te缓冲液溶清，离心使用。
9、步骤1)中所述的dna-sh和tcep投料摩尔比为1：100至1：150。
10、步骤1)中所述的室温为10℃-40℃。
11、步骤2)中所述的naac缓冲溶液的质量浓度为0.05g/ml-1g/ml。
12、步骤3)中所述的dna-sh和马来酰亚胺-peg的投料摩尔比为1：90-1：110。
13、在一些实施方式中，一种马来酰亚胺-peg与dna-sh的连接的改进方法，具体步骤如下：
14、1)dna-sh还原：dna-sh和tcep于室温下进行反应半小时，制得dna-sh还原物；
15、2)除tcep：将步骤1)中制得的dna-sh还原物，加入naac缓冲溶液，涡旋，再加入预冷的无水乙醇，于-20℃冷冻1小时，于4℃，16000rmp离心10min，弃去上清液，加入预冷的85％的乙醇，于4℃，16000rmp离心10min，弃去上清液，底部胶体分散在cb缓冲液中，制得除tcep的产物；
16、3)dna-sh和马来酰亚胺-peg连接反应：将步骤2)中制得的产物，与ho-p1 k-mal或dspe-p1 k-mal，在37℃水浴锅中过夜反应24小时，制得终产品。
17、与现有技术相比，本发明包括以下有益的技术效果：
18、本发明提供的一种马来酰亚胺-peg与dna-sh的连接方法，通过改进工艺，增加了去除tecp的操作后，连接效率大大提高，产物收率大大提高，方法具备优越性，制得的产品具备很好的市场竞争力。
19、在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
1.一种马来酰亚胺-peg与dna-sh的连接的改进方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的dna-sh从冰箱取出后需离心，加入te缓冲液溶清，离心使用。
3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的dna-sh和tcep投料摩尔比为1：100至1：150。
4.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的室温为10℃-40℃。
5.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的naac缓冲溶液的质量浓度为0.05g/ml-1g/ml。
6.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的dna-sh和马来酰亚胺-peg的投料摩尔比为1：90-1：110。
7.一种马来酰亚胺-peg与dna-sh的连接的改进方法，其特征在于，包括以下步骤：
