本发明涉及生物检测，具体为一种基于催化发夹组装的microrna比率型荧光检测纳米系统。
背景技术：
1、癌症是全球范围内的第二大死亡原因。据世界卫生组织(who)报告，癌症病例正在以惊人的速度增加，从2000年的1000万增加到2020年的2000万，死亡病例1000万。癌症的早期诊断对及时治疗、提高患者生存率有着重要意义。microrna(mirna)已被证明在癌症和其他疾病的发展中起关键的调节作用。它是一种短的、内源性的、非编码的单链rna，长度约为19-25个核苷酸。数以百计的mirnas在几乎所有种类的癌症中异常表达，不同的mirnas表达谱与肿瘤的发生、进展和治疗有关，可作为肿瘤抑制因子和癌变促进因子，调控细胞增生、凋亡、侵袭、转移和血管生成等。来自肿瘤组织或液体活检的mirna表达谱可以作为一种很有前途的生物标志物，用于癌症的早期诊断、预后、预测和复发监测。
2、目前mirna检测的金标准是定量逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)。尽管目标mirnas的高灵敏度和特异性，该技术拥有一些内在的缺点如要求热循环器的放大，有限的多路复用能力等不足。荧光共振能量转移是阐明分子相互作用的最强大的现象之一，作为一种生物传感工具，可以提供纳米尺度上的准确信息。许多基于适配体和纳米材料的fret生物测定方法已经被开发出来，用于检测mirnas。亲和探针广泛应用于生物传感器，其中适配体由于其化学和结构稳定性，已成为优势的生物识别元件。
3、mxene纳米片是一种具有二维(2d)层状结构的过渡金属碳化物、过渡金属氮化物或过渡金属碳氮化物。其丰富的元素组成、多样的表面官能团和灵活的带隙使其表现出优于传统二维材料的理想物理化学性能，具备吸附荧光探针及淬灭的能力。将mxene ti3c2单层纳米片与荧光染料修饰的dna探针相结合，其良好的电导率有利于光诱导电子转移，从而实现更高效的荧光传感，有望在荧光检测中得到应用。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种基于催化发夹组装的microrna比率型荧光检测纳米系统。本发明中我们提出利用mxene ti3c2单层纳米片辅助催化发夹组装引发mirna靶标循环，构建具有信号放大功能的荧光生物传感器。该方案的信号放大策略能够实现对低浓度靶标的特异性灵敏检测，提高生物传感器的灵敏度。循环扩增得到荧光共振能量转移(fret)的荧光信号用于实现荧光检测。
2、本发明的技术方案之一为，提供一种microrna比率型荧光检测纳米系统，所述microrna纳米系统包括负载于mxene ti3c2纳米片上的cha模块(发夹探针h1、h2)。
3、所述发夹探针h1与microrna-21互补配对，h2与microrna竞争性结合h1。
4、在本发明中，当系统中存在靶标microrna时，目标microrna可以识别封闭链h1，杂交并释放h1。
5、所述引发片段催化发夹探针h2与h1发生自组装反应。
6、在本发明的一些实施方式中，所述发夹探针分别修饰荧光基团及其相应的淬灭基团。
7、在本发明的一些实施方式中，所述荧光基团修饰于发夹探针h1的3`端，所述淬灭基团修饰于发夹探针h2的5`端。
8、在本发明的一些实施方式中,所述荧光基团包括但不限于本领域中常规的荧光基团，淬灭基团则选自其相应的淬灭基团。
9、在本发明的一些实施方式中，所述荧光基团为fam，相应的淬灭基团为tamra，本领域技术人员也可以使用其他常规的荧光基团及其对应的猝灭基团，荧光基团的选择并不会影响检测效果的产生与否。
10、在本发明中，所述microrna比率型荧光检测纳米系统的作用原理为：该纳米系统由mxene纳米片及两组亚稳态荧光探针，荧光供体h1-fam(识别探针)和荧光受体h2-tamra(扩增探针)。mxene纳米片具有吸附两个发夹探针(h1、h2)的能力，使其固定于纳米片，导致荧光淬灭。当引入目标mirna-21后，mirna-21可以动态打开发夹h1形成h1-rna复合物。h1+mir-21的dg低于h1+h2，说明h1-rna复合物可以打开h2形成h1-h2复合物，并启动催化发夹组装(cha)，使得mir-21脱离重新参与下一次循环。通过这种方式，靶mirna可以促进h1-h2复合物的形成。h1-h2配合物的双螺旋构象是刚性的，由于这种刚性构象的碱基被埋在带密集负电荷的螺旋磷酸盐骨架之间，范德华力被减轻了。此外，fam修饰的h1与tamra修饰的h2相互靠近，产生荧光共振能量转移(fret),使得fam荧光强度降低，tamra强度增强，二者之间的比例关系与mirna-21浓度相关。
11、在本发明的一些实施方式中，所述发夹探针h1的核苷酸序列如seq id no：1所示。
12、在本发明的一些实施方式中，所述发夹探针h2的核苷酸序列如seq id no：2所示。
13、在本发明的一些实施方式中，所述目标mirna-21的核苷酸序列如seq id no：3所示。
14、在本发明的一些实施方式中，若检测样品与所述microrna纳米系统混合孵育后，检测到荧光共振能量转移荧光信号，则说明检测样品中含有目标microrna；如荧光信号无变化或无显著变化，则说明检测样品中不含目标microrna。
15、本发明首次利用mxene ti3c2单层纳米片成功构建得到了一种基于催化发夹组装的microrna比率型荧光检测纳米系统，能够以极低的成本、简单迅速实现目标mirna的无酶扩增检测，反应耗时40min即可进行荧光检测，特异性强，且具有极高的灵敏度。因此，此检测平台在高效精密检测低丰度mirna和生物标志物应用中具有极大的潜力。同时，此研究结果也为进一步研究活细胞内mirna成像奠定了试验和理论基础。
1.一种microrna的比率型荧光检测纳米系统，其特征在于，所述microrna纳米系统包括负载于mxene ti3c2单层纳米片上的cha模块发夹探针h1、h2；所述的h1序列为5`-tcagactgatgttcgtagcttatcaacatcagtctgata agcta-fam-3`；所述的h2序列为5`-ttcgt-(tamra)agcttatcagactgatgttgataagctacgaac atcagt-3`；
2.根据权利要求1所述的一种microrna比率型荧光检测纳米系统，其特征在于，所述发夹探针h1和h2上分别修饰荧光基团及其相应的淬灭基团；
3.制备如权利要求1所述一种microrna比率型荧光检测纳米系统的方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述microrna包括目标microrna-21和三种非特异性互补序列microrna-24、microrna-155、随机序列nc。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，若检测样品与所述microrna纳米系统混合孵育后，检测到荧光共振能量转移fret信号，即荧光供体fam信号降低，荧光受体tamra荧光增强，则说明检测样品中含有目标microrna-21；如荧光信号无变化或无显著变化，则说明检测样品中不含目标microrna-21。
