本发明属于单链抗体，具体涉及一种人博卡病毒hbov1非结构蛋白np1单链抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
1、人博卡病毒(humanbocavirus1,hbov1)是在呼吸道和消化道新发现的一种新型细小病毒，属细小病毒科，博卡病毒属。2005年8月，瑞典科学家首次在儿童呼吸道分泌物鼻咽样本中发现，hbov1可以引起病毒性呼吸道感染相关疾病且在患儿中检出率为1.5％到19％，人博卡病毒经常与其他呼吸道病毒共同感染，混合感染率高达83％。hbov1还可引起病毒血症，严重时也可导致重症感染，表现为缺氧、呼吸窘迫、喘息、咳嗽和发热，可并发气胸、纵隔气肿、皮下气肿和急性呼吸衰竭，甚至危及生命。
2、人博卡病毒颗粒呈正二十面体立体对称结构，直径约为26nm的球形，无包膜病毒，基因组为负义单链线性dna(ssdna)，大小为5543nt，基因组末端具有itr结构。hbov1基因组存在2个主要的开放式阅读框，分别编码非结构蛋白ns1和衣壳蛋白vp1/vp2/vp3，同时第3个阅读框编码非结构蛋白np1。hbov1基因组左端唯一启动子p5负责病毒前体mrna的转录，并经选择性剪切和多聚腺苷酸化生成编码非结构蛋白ns1、ns1-70、ns2、ns3、ns4和np1，以及结构蛋白vp1、vp2和vp3的mrna。np1是博卡病毒属特有的蛋白，序列高度保守，其功能在于：通过抑制pre-mrna中间(pa)p处的多聚腺苷酸化和增强内含子(thirdintron)的选择性剪切调控vpmrna的生成，进而影响衣壳蛋白的生成。但是，np1蛋白是否通过结合病毒dna与rna影响病毒复制与转录后调控尚不清楚，因为目前缺乏有效的np1抗体。目前，检测人博卡病毒hbov1的常用手段是pcr法，但该方法最大的缺点是易出现假阴性。广谱抗病毒药物虽然对人博卡病毒有抑制生长繁殖的作用，如利巴韦林、阿比多尔，但该类药物易出现不良反应，例如白细胞减少、溶血性贫血、眩晕、肌肉痛、关节痛、肝功能损害、味觉异常、疲倦、头痛、胎儿畸形等。大剂量可致心脏损害，有呼吸道疾患者(慢阻肺或哮喘者)可致呼吸困难、胸痛等。
3、随着基因工程抗体的研发，单链抗体scfv(single-chain fragment variable)在理论和实际应用方面的研究越来越备受关注。scfv是最常见的重组抗体之一，是能够保持与抗原有效结合的最小单位，是由轻链和重链抗体可变区通过一段编码连接肽基因拼接后表达的重组蛋白。scfv具有抗原结合特性、穿透力强、体内半衰期短、免疫原性低、可在原核细胞系统表达以及易于进行基因工程操作等优点，故scfv在抗病毒、肿瘤治疗、自身免疫病治疗，靶向药物治疗等方面具有广泛的应用前景。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明旨在提供一种靶向人博卡病毒非结构蛋白np1的单链抗体，为博卡病毒后续研究提供新的工具材料。
2、为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
3、本发明第一方面提供了一种人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体，该单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示。
4、在本发明的np1单链抗体中，重链可变区和轻链可变区通过连接肽连接；在本发明一些实施例中，单链抗体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
5、本发明第二方面提供了编码本发明所述人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体的基因，具体地，基因包括顺次连接的编码重链可变区的核苷酸、连接序列和编码轻链可变区的核苷酸，其中编码重链可变区的核苷酸如seq id no.4所示，编码轻链可变区的核苷酸如seq id no.5所示。在本发明一些实施例中，单链抗体的基因序列如seq id no.6所示。
6、本发明第三方面提供了一种表达人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体的重组质粒，该重组质粒包含初始质粒和编码本发明所述人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体的基因。
7、本发明所述初始质粒可根据实际需要选择，在本发明的一些实施例中，初始质粒为pet23a；在本发明的另一些实施例中，初始质粒为pcdna3.1。
8、本发明第四方面提供了一种表达人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体的重组细胞，具体可通过将本发明所述重组质粒转染至宿主细胞获得。
9、本发明所述宿主细胞可以为真核细胞，也可以为原核细胞。在本发明的一些实施例中，宿主细胞为大肠杆菌；在本发明的另一些实施例中，宿主细胞为293t细胞。
10、本发明第五方面提供了本发明所述人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体的一种制备方法，具体为：将编码本发明所述人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体的基因连接入质粒中，将构建得到的重组质粒转染至宿主细胞中进行表达、纯化，即得单链抗体。
11、本发明第六方面提供了一种融合蛋白，该融合蛋白包括本发明所述的人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体；在本发明的一个实施例中，提供了一个融合表达his标签、sfgfp和单链抗体的融合蛋白，在本发明的另一些实施例中，提供了融合表达ha标签、单链抗体、exin21和/或sv40的融合蛋白。
12、本发明第七方面提供了本发明所述的人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体、或重组质粒、或重组细胞的应用，其至少包括以下：
13、a)在检测人博卡病毒np1抗原中的应用；
14、b)制备治疗或预防人博卡病毒药物中的应用。
15、相对于现有技术，本发明的有益效果为：
16、本发明以hbov1的np1蛋白为抗原制备了特异性的单克隆抗体，通过获取其重链可变区和轻链可变区，构建了靶向np1蛋白的单链抗体。同时，将编码该单链抗体基因的真核载体与hbov1感染性克隆同时转染hek293细胞后，western blotting发现该单链抗体可以抑制病毒非结构蛋白尤其是np1，ns2/3的表达，qpcr检测发现病毒总rna水平也相应下降。此外，将原核表达纯化的单链抗体转染入细胞后，也发现链抗体可以抑制病毒非结构蛋白尤其是np1的表达。总之，该结果初步表明该单链抗体可以特异性结合np1蛋白，进而影响其在病毒复制及转录调控过程中的功能，最终影响病毒的复制增殖。本发明的单链抗体除了已成功应用于np1在病毒复制过程的功能研究外，而其通过结合np1蛋白抑制病毒基因表达和转录的功能，也后期抗博卡病毒药物的开发以及制备靶向np1的嵌合型抗体及人源化抗体提供了重要参考。此外，由于np1蛋白是人细小病毒科博卡病毒属成员的独特蛋白，具有较高的保守性，且在病毒的复制过程中表达量较高，因此该单链抗体还可用于开发靶向该重要的保守的非结构蛋白的诊断试剂盒。
1.一种人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体，其特征在于，包括氨基酸序列如seq idno.1所示重链可变区和氨基酸序列如seq id no.2所示的轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
3.编码权利要求1或2所述人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体的基因，其特征在于，所述基因包括顺次连接的编码重链可变区的核苷酸、连接序列和编码轻链可变区的核苷酸，所述编码重链可变区的核苷酸如seq id no.4所示，编码轻链可变区的核苷酸如seq idno.5所示。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因序列如seq id no.6所示。
5.一种表达人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体的重组质粒，其特征在于，包含权利要求3或4所述的基因。
6.一种表达人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体的重组细胞，其特征在于，通过将权利要求5所述重组质粒转染至宿主细胞获得。
7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌和293t细胞。
8.如权利要求3或4所述的基因、或权利要求5所述的重组质粒、或权利要求6或7所述的重组细胞在制备人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体中的应用。
9.如权利要求1或2所述的人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体、或权利要求5所述的重组质粒、或权利要求6或7所述的重组细胞在检测人博卡病毒np1抗原中的应用。
10.如权利要求1或2所述的人博卡病毒非结构蛋白np1单链抗体、或权利要求5所述的重组质粒、或权利要求6或7所述的重组细胞在制备治疗或预防人博卡病毒药物中的应用。
