本发明涉及生物载体材料以及核酸递送领域，具体涉及一种靶向脾脏的聚合物-脂质组合物、核酸递送纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
1、核酸药物在影响预期生物系统反应方面呈现出前所未有的潜力，其应用涉及到调控基因表达、治疗遗传性疾病以及开拓个性化医疗领域。目前，科学研究已经取得了重要进展，突显了核酸作为干预生物系统反应的独特优势和多样应用的前景。治疗性核酸的范畴涵盖了信使rna(mrna)、小干扰rna(sirna)、反义寡核苷酸、质粒dna、免疫刺激核酸、antagomir、antimir、模拟物(mimic)、supermir和适配子等多种类型。例如mirna抑制剂，抑制一种或多种mirna从而调控mrna产物表达。抑制内源性mirna可增加其下游的靶内源性蛋白质表达，并恢复细胞或生物体内的适当功能。其他核酸则通过rna干扰(rnai)或反义rna的互补结合过程，下调细胞内特定mrna水平，从而降低相应蛋白质的合成。反义寡核苷酸和rnai的治疗应用也非常广泛，因为可用针对靶mrna的任何核苷酸序列合成寡核苷酸构建体。这些靶标可以来自正常细胞、与病症(例如癌症)有关的mrna，甚至是感染因子(例如病毒)的mrna。另一些核酸药物如mrna或质粒dna，可用于促进特定细胞产物的表达，对于治疗与蛋白质或酶缺失相关的疾病具有潜在的治疗效果。可翻译核酸递送在治疗领域应用广泛，其能够产生任意所需的蛋白质序列(无论是否为该系统固有)，表达产物能提高蛋白质存在水平，替代缺失或非功能性蛋白质形式，或者在细胞或生物体内引入新蛋白质及相关功能。
2、随着covid-19mrna疫苗被批准使用后，mrna疗法在现代研究和临床开发中发展迅速，基于mrna的疗法在多种疾病中显示出巨大的潜力。但是，由于mrna的分子量大、聚阴离子性质和固有的化学不稳定性，其在细胞内的传递仍然是一个挑战。为了增强其治疗效果，mrna分子必须到达特定的靶向器官或细胞，并表达足够的目标蛋白质。然而，靶向传递和内吞体逃逸对于mrna递送系统仍然具有挑战性。脂质纳米颗粒(lnps)是目前在体内高效递送外源性mrna的最先进的技术之一，但是当前的药物仍然仅限于系统给药的肝脏靶向mrna药物和肌肉注射疫苗。为了充分发挥mrna药物在其他组织中的全部潜力，有必要开发安全有效的mrna体内递送系统以实现mrna的非肝靶向递送。
3、脾脏是作为基因疫苗靶器官的良好候选者，它是一种重要的淋巴器官，脾内定居着大量淋巴细胞和其他免疫细胞，抗原进入脾脏之后，可被抗原提呈细胞摄取并提呈给t细胞，诱导t细胞活化和增殖，产生致敏t淋巴细胞。脾脏是针对血液中的抗原产生免疫应答的场所，且90％左右的循环血液要经过脾，脾脏的这种生物学特性使得利用靶向递送技术将经静脉注射的肿瘤抗原递至脾脏，通过诱导快速的抗肿瘤免疫应答，发挥高效地抗肿瘤作用成为可能。因此，开发一种靶向脾脏的核酸递送系统具有重要意义。
技术实现思路
1、基于此，本发明的目的是提供一种靶向脾脏的核酸递送系统，其可以将核酸药物优先递送至脾脏。
2、为了实现上述发明目的，本发明包括如下技术方案。
3、一方面，本发明提供了一种聚合物-脂质组合物，以摩尔百分比计，其包含如下组分：
4、永久性阳离子脂质4～39％
5、可电离阳离子脂质60～95％
6、两亲性嵌段共聚物0.05～10％。
7、在其中一些实施例中，以摩尔百分比计，所述聚合物-脂质组合物包含如下组分：
8、永久性阳离子脂质4～19％
9、可电离阳离子脂质80～95％
10、两亲性嵌段共聚物0.08～5％。
11、在其中一些实施例中，以摩尔百分比计，所述聚合物-脂质组合物包含如下组分：
12、永久性阳离子脂质4.5～16.8％
13、可电离阳离子脂质83～94.5％
14、两亲性嵌段共聚物0.1～4％。
15、在其中一些实施例中，所述永久性阳离子脂质与可电离阳离子脂质的摩尔比为0.03～0.5：1，优选为0.05～0.2：1；例如，具体可以为0.05：1，或0.1：1，或0.2：1等。
16、在其中一些实施例中，所述永久性阳离子脂质是由一个或多个阳离子头部、一个或多个连接键以及一个或多个疏水尾部组成，其阳离子头部是携带永久正电荷的季铵盐，其疏水尾部是c6-c24烷基或者c6-c24不饱和链烃基。
17、在其中一些实施例中，所述永久性阳离子脂质的结构式如下：
18、
19、其中：r1选自：c6-c24烷基、c6-c24不饱和链烃基、
20、各r2分别独立选自：c6-c24烷基、c6-c24不饱和链烃基；
21、r3选自：c1-c8烷基；
22、r1′和r1″分别独立选自：c1-c24烷基、c2-c24不饱和链烃基；
23、r1″′选自：氢、c1-c8烷基、c2-c8不饱和链烃基、羟基取代的c1-c8烷基、羟基取代的c2-c8不饱和链烃基、
24、x1是一价阴离子，例如可以是氯离子、氟离子、溴离子等。
25、在其中一些实施例中，r1选自：c14-c20烷基、c14-c20不饱和链烃基、
26、
27、各r2分别独立选自：c10-c20烷基、c10-c20不饱和链烃基；
28、r3选自：c1-c3烷基；
29、r1′和r1″分别独立选自：c1-c8烷基、c2-c8不饱和链烃基；
30、r1″′选自：氢、c14-c20烷基、c14-c20不饱和链烃基、羟基取代的c1-c4烷基、羟基取代的c2-c4不饱和链烃基、
31、在其中一些实施例中，所述永久性阳离子脂质的结构式如下：
32、
33、其中：各r2分别独立选自：c14-c20烷基、c14-c20不饱和链烃基；
34、r4、r4′和r4″分别独立选自：c1-c4烷基、c2-c4不饱和链烃基、羟基取代的c1-c4烷基、羟基取代的c2-c4不饱和链烃基；
35、x1是一价阴离子。
36、在其中一些实施例中，各r2分别独立选自：含有一个或者两个碳碳双键的c14-c20不饱和链烃基。
37、在其中一些实施例中，各r2分别独立选自：含有一个或者两个碳碳双键的c16-c20不饱和链烃基。
38、在其中一些实施例中，r4、r4′和r4″分别独立选自：甲基、乙基、丙基。
39、在其中一些实施例中，所述永久性阳离子脂质选自dotap、dotma、dmrie、dospa、dodab、18:1epc、ttab、dtab、ddab、dorie、dodac中的一种或多种组合。
40、在其中一些实施例中，所述可电离阳离子脂质是由一个或多个阳离子头部、一个或多个连接键以及一个或多个疏水尾部组成，其阳离子头部是叔胺基，其疏水尾部是c6-c24烷基或者c6-c24不饱和链烃基；所述可电离阳离子脂质的叔胺基在低ph值下被质子化以携带正电荷，其在正常生理ph值条件下呈现电中性。
41、在其中一些实施例中，所述可电离阳离子脂质选自sm102、alc-0315、d-lin-mc3-dma、dodap、dlindap、a2-iso5-2dc18、ckk-e12、c12-200、306o110、tt3、bame-016b、ftt5、of-deg-lin中的一种或者多种组合。
42、在其中一些实施例中，所述两亲性嵌段共聚物的数均分子量为1000～40000道尔顿，优选为2000～20000道尔顿，更优选为3000～10000道尔顿，更优选为4000～8000道尔顿，更优选为6000～8000道尔顿，具体可以为7000道尔顿。
43、在其中一些实施例中，所述两亲性嵌段共聚物中的亲水性链段衍生自选自以下亲水性聚合物：聚乙二醇、聚亚烷基二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺，及其衍生物。
44、在其中一些实施例中，所述亲水性链段为单甲氧基聚乙二醇、单乙酰氧基聚乙二醇、聚乙二醇和/或聚乙烯-共-丙烯二醇。
45、在其中一些实施例中，所述亲水性链段的数均分子量为500～20000道尔顿，优选为1000～5000道尔顿，更优选为1500～3000道尔顿，更优选为1800～2500道尔顿，具体可以为2000道尔顿。
46、在其中一些实施例中，所述两亲性嵌段共聚物中的疏水性链段衍生自选自以下疏水性聚合物：聚酯、聚酐、聚氨基酸、聚原酸酯和聚膦嗪。
47、在其中一些实施例中，所述疏水性链段选自：聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯、聚二氧六环-2-酮、聚乳酸-共-乙交酯、聚乳酸-共-二氧六环-2-酮、聚乳酸-共-己内酯、聚乙醇酸-共-己内酯。
48、在其中一些实施例中，所述疏水性链段的数均分子量为500～20000道尔顿，优选为1000～10000道尔顿，优选为2000～8000道尔顿，更优选为3000～7000道尔顿，更优选为4000～6000道尔顿，具体可以为5000道尔顿。
49、在其中一些实施例中，所述两亲性嵌段共聚物的亲水性链段与疏水性链段的重量比为1:1～10，优选为1:1～5，更优选为1:1～2.5，更优选1:2～3；具体可以为1:1，或1:2.5。
50、在其中一些实施例中，所述两亲性嵌段共聚物选自聚乙二醇-聚(乳酸-共-乙交酯)嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乳酸酯嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乙交酯嵌段共聚物、聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物中的一种或多种；优选地，所述两亲性嵌段共聚物的数均分子量为4000～7000道尔顿，优选为7000道尔顿，其中聚乙二醇的数均分子量为2000道尔顿。
51、在其中一些实施例中，以摩尔百分比计，所述聚合物-脂质组合物由如下组分组成：
52、dotap 4.5～16.8％
53、sm-102 83～94.5％
54、peg-b-plga 0.1～4％；
55、所述peg-b-plga中peg链段的数均分子量为2000道尔顿，所述peg-b-plga中plga链段的数均分子量为5000道尔顿。
56、在其中一些实施例中，以摩尔百分比计，所述聚合物-脂质组合物由16.60％的dotap、83.00％的sm-102和0.40％的peg-b-plga组成。
57、在其中一些实施例中，以摩尔百分比计，所述聚合物-脂质组合物由9.03％的dotap、90.27％的sm-102和0.7％的peg-b-plga组成。
58、在其中一些实施例中，以摩尔百分比计，所述聚合物-脂质组合物由4.71％的dotap、94.29％的sm-102和1.00％的peg-b-plga组成。
59、在其中一些实施例中，以摩尔百分比计，所述聚合物-脂质组合物由16.65％的dotap、83.25％的sm-102和0.10％的peg-b-plga组成。
60、在其中一些实施例中，以摩尔百分比计，所述聚合物-脂质组合物由8.73％的dotap、87.27％的sm-102和4.00％的peg-b-plga组成。
61、在其中一些实施例中，以摩尔百分比计，所述聚合物-脂质组合物由9.05％的dotap、90.55％的sm-102和0.40％的peg-b-plga组成。
62、第二个方面，本发明提供了所述聚合物-脂质组合物作为递送载体在制备能够靶向脾脏的核酸药物递送系统中的应用。本发明所述的聚合物-脂质组合物可以作为核酸药物的递送载体，并且将其作为载体递送核酸药物时，具有脾脏靶向性，能够优先将核酸药物递送到脾脏，并有效产生免疫应答。
63、第三个方面，本发明提供了一种靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒，由本发明所述的聚合物-脂质组合物和核酸制备得到。
64、在其中一些实施例中，所述聚合物-脂质组合物中总阳离子脂质与核酸的氮磷摩尔比为4～12：1，优选为6～10：1，优选为6～9：1，更优选为7～8：1；具体可以为7：1，或8：1等。
65、在其中一些实施例中，所述核酸选自：信使rna(mrna)、小干扰rna(sirna)、mirna、snrna、转移rna(trna)、反义寡核苷酸、双链dna(dsdna)、单链dna(ssdna)、质粒dna(pdna)、核糖体rna(rrna)。
66、在其中一些实施例中，所述核酸为mrna，所述mrna为luci-mrna、egfp-mrna、cre-mrna或者ova-mrna。
67、在其中一些实施例中，所述的靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒粒径为50nm～200nm。
68、第四个方面，本发明还提供了所述的靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
69、(a)将永久性阳离子脂质、可电离阳离子脂质和两亲性嵌段共聚物溶解于有机溶剂中，形成有机相溶液；
70、(b)将核酸溶解在ph为4.5～6.8的缓冲液中，形成核酸溶液；
71、(c)将所述有机相溶液与核酸溶液混合，除去有机溶剂，即得所述靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒。
72、在其中一些例中，所述有机溶剂为乙醇和/或二甲基亚砜。
73、在其中一些例中，所述有机相溶液中永久性阳离子脂质、可电离阳离子脂质和两亲性嵌段共聚物的总浓度为1mg/ml～15mg/ml。
74、在其中一些例中，所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或者柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液。
75、在其中一些例中，步骤(c)所述混合的方法包括：微流控、微流体、涡旋、吹打。
76、在其中一些例中，步骤(c)包括：使用微流控芯片将所述有机相溶液与核酸溶液混合；所述有机相溶液与核酸溶液的流速比为1：2～6，总流速为12ml/min～24ml/min。
77、第五个方面，本发明还提供了所述的靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒在制备用于治疗、预防或诊断疾病的药物中的应用，所述疾病为肿瘤、炎性疾病、基因缺陷、传染病和自身免疫疾病。
78、在其中一些实施例中，所述靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒中的核酸为ova-mrna，所述疾病为黑色素瘤。
79、为了使核酸药物在体内有效发挥作用，负载核酸的纳米颗粒需要克服多种细胞外和细胞内屏障。以mrna为例，首先，mrna需要被纳米颗粒成功包裹；其次，纳米颗粒需要到达靶组织，然后被靶细胞内化；最重要的是，mrna必须逃脱核内体，翻译成功能性蛋白质。另外，负载核酸的纳米颗粒制剂在临床应用时，最好可以在4℃条件下长期储存，以减少在运输的贮存过程中的经济负担。而负载核酸的纳米粒子的物理化学特性是保证其有效性的基础，例如，较高的核酸包封率是决定有效转染和适宜粒径的关键因素；zeta电位也在一定程度上影响其毒性和体内分散能力，zeta电位越高，生理条件下红细胞的溶血能力越强，毒性也越大。而pdi则在一定程度上反映了纳米粒子的均一性和稳定性；粒径大小是决定纳米药物的半衰期和在体内分布的关键参数，粒径较小的纳米药物更容易逃脱吞噬细胞的摄取。合适的纳米粒粒径及电位会降低体内栓塞的概率，促进体内深部组织的穿透，提高细胞的摄取及转染效率。在此基础上，本发明的发明人发现以永久性阳离子脂质、可电离阳离子脂质和两亲性嵌段共聚物为原料，按照特定配比配合，通过亲疏水的超分子作用力可以发生自组装形成聚合物-脂质纳米颗粒，在低ph值条件下，可电离阳离子脂质的叔胺质子化形成带正电的亲水端和永久性阳离子脂质带正电的季铵亲水端，使纳米颗粒具有较强的正电荷，通过静电相互作用可以结合带负电荷的核酸药物，从而获得包封率高、粒径和pdi较小、zeta电位较小的核酸纳米颗粒。该核酸纳米颗粒可以有效增强其递送核酸至生物体内的效率，并能够将核酸优先递送至脾脏。
80、本发明的靶向脾脏的聚合物-脂质组合物及其核酸递送纳米颗粒具有如下有益效果：
81、在本发明中，用于包载核酸的聚合物-脂质组合物颗粒包含特定配比的永久性阳离子脂质、可电离阳离子脂质和两亲性嵌段共聚物，当其包载核酸时还含有核酸，其中两亲性嵌段共聚物的用量较小。该纳米颗粒无需通过共价或非共价修饰引入靶向配体，仅通过优选组分及调节组分间比例实现了在系统给药时规避肝脏功能性递送，实现了脾脏选择性递送，提高了内源性靶向脾脏递送核酸的效果。
82、本发明的聚合物-脂质组合物负载核酸时，组合物与核酸(例如mrna)结合紧密，能够实现对核酸(例如mrna)的高效包载，防止mrna泄漏，其包封率高，可以提高mrna的稳定性，改善体内转染效率。
83、进一步地，通过优选两亲性嵌段聚合物、永久性阳离子脂质和可电离阳离子脂质的特定种类和配比，在提高核酸的脾脏递送特异性的同时，可以有效降低纳米颗粒的空壳率，增强核酸药物(mrna)在胞内的表达效果，提高其内涵体逃逸效率，从而提高核酸药物在脾脏的表达效率，提高其对肿瘤等相应疾病的治疗效果；并且所得纳米颗粒的长期稳定性好，4℃条件下长期储存，其粒径基本不会发生变化。
84、本发明所述的脂质、两亲性嵌段共聚物及其组合物具有很好的生物相容性，所使用的聚合物及脂质均为常用的药用辅料，来源稳定丰富，生物安全性好。
85、本发明的核酸纳米颗粒的制备工艺简单，适合大规模生产，该纳米颗粒适合于不同核酸分子量长度，不同核酸序列的核酸药物的递送，具有普适性。
1.一种聚合物-脂质组合物，其特征在于，以摩尔百分比计，其包含如下组分：
2.根据权利要求1所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，以摩尔百分比计，其包含如下组分：
3.根据权利要求2所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，以摩尔百分比计，其包含如下组分：
4.根据权利要求1所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述永久性阳离子脂质与可电离阳离子脂质的摩尔比为0.03～0.5：1，优选为0.05～0.2：1，或0.05：1，或0.1：1，或0.2：1。
5.根据权利要求1-4任一项所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述永久性阳离子脂质是由一个或多个阳离子头部、一个或多个连接键以及一个或多个疏水尾部组成，其阳离子头部是携带永久正电荷的季铵盐，其疏水尾部是c6-c24烷基或者c6-c24不饱和链烃基。
6.根据权利要求5所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述永久性阳离子脂质的结构式如下：
7.根据权利要求6所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，r1选自：c14-c20烷基、c14-c20不饱和链烃基、
8.根据权利要求7所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述永久性阳离子脂质的结构式如下：
9.根据权利要求8所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，各r2分别独立选自：含有一个或者两个碳碳双键的c14-c20不饱和链烃基。
10.根据权利要求7所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述永久性阳离子脂质选自dotap、dotma、dmrie、dospa、dodab、18:1epc、ttab、dtab、ddab、dorie、dodac中的一种或多种组合。
11.根据权利要求1-4任一项所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述可电离阳离子脂质是由一个或多个阳离子头部、一个或多个连接键以及一个或多个疏水尾部组成，其阳离子头部是叔胺基，其疏水尾部是c6-c24烷基或者c6-c24不饱和链烃基；所述可电离阳离子脂质的叔胺基在低ph值下被质子化以携带正电荷，其在生理ph值条件下呈现电中性。
12.根据权利要求10所述的的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述可电离阳离子脂质选自sm102、alc-0315、d-lin-mc3-dma、dodap、dlindap、a2-iso5-2dc18、ckk-e12、c12-200、306o110、tt3、bame-016b、ftt5、of-deg-lin中的一种或者多种组合。
13.根据权利要求1-4任一项所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述两亲性嵌段共聚物的数均分子量为1000～40000道尔顿，优选为2000～20000道尔顿，或3000～10000道尔顿，或4000～8000道尔顿，或6000～8000道尔顿，或7000道尔顿。
14.根据权利要求1-4任一项所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述两亲性嵌段共聚物中的亲水性链段衍生自选自以下亲水性聚合物：聚乙二醇、聚亚烷基二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺，及其衍生物。
15.根据权利要求14所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述亲水性链段为单甲氧基聚乙二醇、单乙酰氧基聚乙二醇、聚乙二醇和/或聚乙烯-共-丙烯二醇。
16.根据权利要求14所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述亲水性链段的数均分子量为500～20000道尔顿，优选为1000～5000道尔顿，或1500～3000道尔顿，或1800～2500道尔顿，或2000道尔顿。
17.根据权利要求1-4任一项所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述两亲性嵌段共聚物中的疏水性链段衍生自选自以下疏水性聚合物：聚酯、聚酐、聚氨基酸、聚原酸酯和聚膦嗪。
18.根据权利要求17所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述疏水性链段选自：聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯、聚二氧六环-2-酮、聚乳酸-共-乙交酯、聚乳酸-共-二氧六环-2-酮、聚乳酸-共-己内酯、聚乙醇酸-共-己内酯。
19.根据权利要求18所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述疏水性链段的数均分子量为500～20000道尔顿，优选为1000～10000道尔顿，或2000～8000道尔顿，或3000～7000道尔顿，或4000～6000道尔顿，或5000道尔顿。
20.根据权利要求1-4任一项所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述两亲性嵌段共聚物的亲水性链段与疏水性链段的重量比为1:1～10，优选为1:1～5，或1:1～2.5，或1:2～3，或1:1，或1:2.5。
21.根据权利要求1-4任一项所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，所述两亲性嵌段共聚物选自聚乙二醇-聚(乳酸-共-乙交酯)嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乳酸酯嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乙交酯嵌段共聚物、聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物中的一种或多种；
22.根据权利要求1-4任一项所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，以摩尔百分比计，其由如下组分组成：
23.根据权利要求22所述的聚合物-脂质组合物，其特征在于，以摩尔百分比计，其由16.60％的dotap、83.00％的sm-102和0.40％的peg-b-plga组成；
24.权利要求1-23任一项所述的聚合物-脂质组合物作为递送载体在制备能够靶向脾脏的核酸药物递送系统中的应用。
25.一种靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒，其特征在于，由权利要求1-23任一项所述的聚合物-脂质组合物和核酸制备得到。
26.根据权利要求25所述的靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒，其特征在于，所述聚合物-脂质组合物中总阳离子脂质与核酸的氮磷摩尔比为4～12：1，优选为6～10：1，优选为6～9：1，或7～8：1，或7：1，或8：1。
27.根据权利要求25或者26所述的靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒，其特征在于，所述核酸选自：mrna、sirna、mirna、snrna、trna、dsdna、ssdna、pdna、rrna。
28.根据权利要求27所述的靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒，其特征在于，所述核酸为mrna，所述mrna为luci-mrna、egfp-mrna、cre-mrna或者ova-mrna。
29.根据权利要求25或者26所述的靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒，其特征在于，其粒径为50nm～200nm。
30.一种权利要求25-29任一项所述的靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
31.根据权利要求30所述的靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇和/或二甲基亚砜；和/或，
32.根据权利要求31所述的靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(c)包括：使用微流控芯片将所述有机相溶液与核酸溶液混合；所述有机相溶液与核酸溶液的流速比为1：2～6，总流速为12ml/min～24ml/min。
33.权利要求25-29任一项所述的靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒在制备用于治疗、预防或诊断疾病的药物中的应用，所述疾病为肿瘤、炎性疾病、基因缺陷、传染病和自身免疫疾病。
34.根据权利要求33所述的应用，其特征在于，所述靶向脾脏的核酸递送纳米颗粒中的核酸为ova-mrna，所述疾病为黑色素瘤。
