本发明属于荧光探针，具体涉及一种溶酶体靶向近红外荧光探针及其制备方法和在羧酸酯酶检测中的应用，以实现在近红外区域成像检测细胞溶酶体内的ce，具有高选择性、高灵敏度、快速响应、低生物毒性的优点。
背景技术：
1、羧酸酯酶(carboxylesterase，ce)是一种哺乳动物中常见的丝氨酸水解酶。主要分布在肝脏中，在多种内源性酯类、含酯类药物和环境毒物的代谢中起着至关重要的作用，催化多种含酯或酰胺的底物裂解成相应的醇或羧酸，可以水解多种内生素和外生素化合物中的酯、硫酯、酰胺和氨基甲酸酯键。ce在人体健康以及外源性物质代谢中的重要作用，通过有效的调节ce活性水平可以影响内生物的代谢或者提高酯类药物疗效引起了研究者的广泛关注。迄今为止，已经报到的几种用于ce的检测方法，包括免疫学、色谱法、化学发光、质谱分析、荧光探针。与其他常规方法相比，荧光探针的生物成像技术具有更高的选择性，灵敏度，更少的侵入性和易于操作性越来越具有吸引力。尽管之前报道过用于特异性检测溶酶体ce的探针，但大多数的荧光探针都存在响应时间较长、检测限较高和荧光通道发射波长较短等不足。
2、溶酶体是分解蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的细胞器，在多种生物学功能中起着至关重要的作用。溶酶体酶与各种碳水化合物、脂质和蛋白质的细胞内消化有关，它们的故障会导致大量的遗传性溶酶体贮积症。因此开发一种易于获取，拥有良好水溶性并提高其选择性和快速响应，对于亚细胞溶酶体的ce水平的组织成像和功能仍然是非常有必要的。
3、荧光探针法是检测ce活性最有效的方法之一。然而，目前报道的羧酸酯酶荧光探针大都存在反应时间较长、灵敏度差以及激发和发射波长短等问题。
技术实现思路
1、本发明旨在提供一种溶酶体靶向近红外荧光探针及其制备方法和在羧酸酯酶检测中的应用，所要解决的技术问题是通过分子设计得到一种可以特异性靶向溶酶体中，且能够快速响应ce并具有近红外荧光性能，以实现通过近红外荧光成像实时检测活细胞溶酶体中ce变化。细胞实验证实该探针毒性低、生物兼容性好、响应速度快、特异性强、可定位溶酶体细胞器、近红外成像等优点。
2、本发明溶酶体靶向近红外荧光探针，简记cepb，以罗丹明为母体，其结构式如下所示：
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4、本发明溶酶体靶向近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
5、步骤1：在冰浴环境下，将环己酮(1.98ml，20mmol)滴加至浓硫酸(20ml)中，然后分批缓慢加入4-二乙氨基酮酸(3.13g，10mmol)并在90℃下不断搅拌3h，反应完成后迅速倒入冰水中，加入高氯酸(2ml)，过滤生成的沉淀并用冷水洗涤，得到化合物1，为红色固体，其不经纯化直接用于下一步反应；
6、步骤2：在n2环境下，将对羟基苯甲醛(508.2mg，1.07mmol)和化合物1(181.4mg，1.49mmol)溶于乙酸(15ml)中，90℃下回流反应过夜，在减压条件下蒸干溶剂后用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机层并经无水硫酸钠干燥、减压蒸馏及柱色谱分离，展开剂为二氯甲烷/甲醇＝30/1(v/v)，纯化后得到cepb-oh，为蓝紫色固体；
7、步骤3：在0℃下，将对硝基苯基氯甲酸酯(0.54mg，2.7mmol)和少许三甲胺(600μl)依次加入含cepb-oh(0.43mg，0.9mmol)的乙腈中，然后室温下反应3h，得到化合物2，无需纯化，直接用于下一步反应；
8、步骤4：将化合物2溶于乙腈，然后依次加入4-哌啶基哌啶(0.34mg，2mmol)和三乙胺(370μl)，继续搅拌1h，之后在减压条件下蒸干溶剂，随后用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机层并经无水硫酸钠干燥、减压蒸馏及柱色谱分离，柱色谱分离纯化的展开剂为二氯甲烷/甲醇＝100：1～10/1(v/v)，纯化后得到cepb，为黑紫色固体。
9、反应路线如下所示：
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11、本发明溶酶体靶向近红外荧光探针在制备羧酸酯酶检测试剂中的应用。
12、所述检测试剂能够区分正常细胞和癌细胞，能够实现近红外成像以及细胞溶酶体中ce的快速响应检测。
13、具体检测方法如下：
14、将本发明cepb溶于dmso(5ml)中制得2mm的母液，取15μl cepb母液加入到3mlpbs溶剂中，得到最终浓度为10μm的测试液。在0.2m的磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph＝7.4)中获得的uv-vis吸收光谱和荧光发射光谱来检测cepb的光谱性质。在反应体系中加入ce(本专利检测时使用的为cas号：9016-18-6的羧酸酯酶)后，cepb的吸收光谱和荧光发射均表现出明显的变化。cepb的吸收峰在545nm处上升。645nm处荧光随着ce浓度的增加而增强，使得该探针适合于近红外荧光成像。为了进一步研究cepb对ce的响应，我们通过荧光光谱测定了cepb对ce的荧光响应的时间过程。加入10u/ml的ce后，在2分钟内荧光强度达到稳定状态。在此基础上，用不同浓度的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(4-(2-aminoethyl)benzenesulfonylfluoride hydrochloride，aebsf，一种羧酸酯酶抑制剂)与10u/ml的ce共育后加入cepb，645nm处的荧光强度逐渐减弱，进一步证明了cepb对ce的快速响应效果。
15、本发明提供的羧酸酯酶荧光探针可在远红外到近红外区且高选择性的检测ce，体外响应时间为40秒，检测限为32mu/ml。此外，鉴于探针的毒性低、生物兼容性能够在活体模型中具有极大的应用潜力。
1.一种溶酶体靶向近红外荧光探针，其特征在于其结构式如下所示：
2.一种权利要求1所述溶酶体靶向近红外荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
5.权利要求1所述溶酶体靶向近红外荧光探针在制备羧酸酯酶检测试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
