(一)本发明涉及微生物催化领域，具体涉及一种伯克霍尔德菌(burkholderia)zjutq19及其在农药中间体手性选择性拆分中的应用。
背景技术：
0、(二)背景技术
1、甲霜灵是一种手性农药，属于苯酰胺类内吸性杀菌剂，可以有效的防治各种农作物中由疫霉或毛霉属引起的疾病，甲霜灵具有一定的广谱性，还可作用于非食品类作物，如各种观赏植物。甲霜灵分子中有一个手性碳原子，因此其含有一对对映异构体：r型甲霜灵和s型甲霜灵。目前，市面上销售的甲霜灵仍以外消旋体为主，然而甲霜灵的杀菌活性主要来源于r型甲霜灵(称为精甲霜灵)，其杀菌活性是s型的20-30倍，在某些领域内甚至可以达到100倍以上，同时r型甲霜灵在土壤中的降解速度更快。因此，与外消旋甲霜灵相比，r型甲霜灵可以显著提升药效，还可以减少农药用量降低成本，具有更好的环境相容性，有广阔的市场前景。
2、如今，手性药物的制备以化学法为主，但化学法的能耗较高且较生物酶法污染严重，而生物催化法具有反应温和、特异选择性高、污染少、副反应少等特点，因此生物催化法制备手性药物具有极大潜力，正成为手性药物研究的热门领域。
3、(r,s)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯是制备甲霜灵的重要中间体，利用生物酶的高特异选择性和立体选择性制备r-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯，可以实现r-甲霜灵的制备。从环境样品中通过富集培养筛选出可手性选择性水解(r,s)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的降解菌是一种获取所需生物催化剂的快捷手段，具有较大的现实意义。
4、(r,s)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的结构式：
5、
技术实现思路
0、(三)
技术实现要素：
1、本发明目的是提供一种伯克霍尔德菌(burkholderia)zjutq19及在拆分甲霜灵中间体(r,s)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯生成r-2,6-二甲基苯基氨基丙酸中的应用，该菌具有良好的手性选择性(r-选择性)，生成的高手性纯度的r-2,6-二甲基苯基氨基丙酸可以用来生产高手性纯度的r-甲霜灵。
2、本发明采用的技术方案是：
3、本发明提供一株用于手性拆分的新菌株--伯克霍尔德菌(burkholderia)zjutq19，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20232467，保藏日期2023年12月06日，保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。
4、本发明还提供一种伯克霍尔德菌zjutq19在催化手性拆分(r,s)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯制备r-2,6-二甲基苯基氨基丙酸中的应用。
5、进一步，所述的应用为：将伯克霍尔德菌zjutq19经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以(r,s)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯为底物，以吐温80为助溶剂，以ph6-10的缓冲液为反应介质构成反应体系，于20-40℃、200rpm条件下反应完全，反应液分离纯化，获得r-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。
6、进一步，所述反应介质为100mm磷酸钠缓冲液(ph8.0)。反应条件优选为35℃、200rpm条件下反应6h。
7、进一步，所述催化剂加入终浓度为10-50g/l，优选20g/l；所述底物加入终浓度为2-10g/l，优选5g/l；所述吐温80加入终浓度为1-5g/l，优选5g/l。
8、进一步，所述催化剂按如下方法制备：将伯克霍尔德菌zjutq19在lb固体培养基上划线，30℃培养24h，挑取平板上的单菌落到lb液体培养基，30℃，200rpm培养至od600≈1.0，作为种子液；将种子液以体积浓度1％接种量接种至发酵培养基，30℃，200rpm下培养12h，发酵液在4℃，8000rpm条件下离心10min，得到湿菌体。
9、lb液体培养基：酵母粉5.0g/l，胰蛋白胨10.0g/l，nacl 10.0g/l，自来水溶解，调节ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。lb固体培养基在lb液体培养基中添加20g/l琼脂粉。
10、发酵培养基：酵母粉12.0g/l，胰蛋白胨15.0g/l，甘油10.0g/l，na2hpo4·12h2o8.9g/l，kh2po4 3.4g/l，nh4cl 2.7g/l，na2so4 0.7g/l，mgso4·7h2o 0.3g/l，自来水溶解，调节ph7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
11、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明的伯克霍尔德菌zjutq19易培养、稳定性高，同时在催化农药甲霜灵的中间体(r,s)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯水解有较好的r-立体选择性，还具有较高的底物转化率。在优化后的催化体系下，菌株zjutq19催化水解(r,s)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯6h，底物转化率为48.59％，产物对应体过量值达到85.4％(r-选择性)。
1.伯克霍尔德菌(burkholderia)zjutq19，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20232467，保藏日期2023年12月06日，保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述伯克霍尔德菌zjutq19在催化手性拆分(r,s)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯制备r-2,6-二甲基苯基氨基丙酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用为：将伯克霍尔德菌zjutq19经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以(r,s)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯为底物，以吐温80为助溶剂，以ph6-10的缓冲液为反应介质构成反应体系，于20-40℃、200rpm条件下反应完全，反应液分离纯化，获得r-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述反应介质为100mm、ph8.0磷酸钠缓冲液。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，反应条件为35℃、200rpm条件下反应6h。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述催化剂加入终浓度为10-50g/l；所述底物加入终浓度为2-10g/l；所述吐温80加入终浓度为1-5g/l。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述催化剂按如下方法制备：将伯克霍尔德菌zjutq19在lb固体培养基上划线，30℃培养24h，挑取平板上的单菌落到lb液体培养基，30℃，200rpm培养至od600≈1.0，作为种子液；将种子液以体积浓度1％接种量接种至发酵培养基，30℃，200rpm下培养12h，发酵液在4℃，8000rpm条件下离心10min，得到湿菌体；发酵培养基组成：酵母粉12.0g/l，胰蛋白胨15.0g/l，甘油10.0g/l，na2hpo4·12h2o 8.9g/l，kh2po43.4g/l，nh4cl 2.7g/l，na2so4 0.7g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，自来水溶解，调节ph7.0。
