本发明涉及分子遗传育种领域，具体涉及与番茄雄性不育突变位点ms30共分离的snp和kasp分子标记的特异性引物组合及其应用。
背景技术：
1、已经鉴定出的番茄雄性不育突变体分为三种类型：孢子不育、功能不育和结构不育。大多数番茄雄性不育突变体为孢子不育型，只有少数已被克隆，如slms10和slms32。位置不育(positional sterile,ps)是第一个报道的番茄功能不育突变体。它能产生正常的花粉，然而，由于花药不开裂，其花粉粒仍被包裹在花药室内，导致无法正常授粉。无雄蕊(stamenless，sl)是番茄中报道的第一个结构不育突变体，表现出雄蕊完全转化为心皮，花瓣部分转化为萼片。
2、番茄这几种类型的雄性不育系在杂交种子生产中各有优点和缺点。雄性不育系ms10和ms32被认为有利于杂交种子的生产，因为它们表现出柱头外露，无需人工去雄即可进行花粉授粉，完全不育且不育性稳定。然而，这两个不育系的应用有一些缺点，例如柱头外露花的比率取决于环境和基因型。外露柱头(ex)不育系最初被认为有利于杂交种子的生产，因为不育系易于扩繁，不需要人工去雄，并且杂交种子产量高。然而，柱头外露率容易受基因型和外界环境条件的影响。ps-2存在自花授粉和不得不进行人工去雄的等缺点。7b-1可用于杂交种子生产，但缺乏功能共显性标记，回交转育效率低。因此，有必要定位其它的雄性不育基因，并开发用于标记辅助选择(mas)的共显性分子标记。
技术实现思路
1、本发明的首要目的是提供与番茄雄性不育突变位点ms30共分离的snp。
2、本发明的再一目的是提供与番茄雄性不育突变位点ms30共分离的snp的kasp分子标记的特异性引物组合。
3、本发明的再一目的是提供鉴定番茄雄性不育材料的方法。
4、本发明的再一目的是提供编辑番茄ms30基因获得番茄雄性不育突变体的方法。
5、本发明确定了与番茄雄性不育突变位点ms30共分离的snp分子标记，该snp分子标记位于番茄solyc06g059970基因编码序列seq id no：1和seq id no：3的第176bp处，多态性为g/t，该碱基为g的番茄可育、该碱基为t的番茄则雄性不育。该snp的物理位置为番茄6号染色体上第35,578,356碱基(sl4.0版本)，该碱基为c的番茄可育、该碱基为a的番茄则雄性不育。
6、本发明公开了一个与番茄雄性不育位点ms30共分离的kasp分子标记ms30k，可检测物理位置为番茄6号染色体上第35,578,356碱基(sl4.0版本)的snp，该碱基为c的番茄可育、该碱基为a的番茄则雄性不育。对应反义链编码的ms30(solyc06g059970)基因中，该碱基为g的番茄可育、该碱基为t的番茄则雄性不育，用pcr扩增所述分子标记ms30k的特异性引物组合如下：
7、(1)两条特异性引物：
8、ms30k-f1：5’-gaaggtgaccaagttcatgctttgacttacgtagtagaaggga-3’，
9、ms30k-f2：5’-gaaggtcggagtcaacggattcttacgtagtagaagggc-3’，
10、(2)一条通用引物：
11、ms30k-r：5’-ctttgctagttctggaaagatgcatg-3’
12、其中，ms30k-f1含fam荧光接头序列，为雄性不育基因型的特异引物；ms30k-f2含hex荧光接头序列，为雄性可育基因型的特异引物；ms30k-r为共同的反向引物。
13、根据本发明的鉴定番茄雄性不育材料的方法，所述方法包括以下步骤：
14、使用上述分子标记ms30k的特异性引物组合扩增待鉴定番茄材料的dna；
15、扩增结束后使用配套仪器读取扩增产物的fam荧光值和hex荧光值，软件分别以fam荧光值和hex荧光值作为每个样品的横坐标和纵坐标绘制在平面直角坐标系中，并根据样品所在样品簇判定样品的基因型，靠近横轴(fam轴，波长465-510nm)，说明只检测到ms30k-f1所含fam荧光序列对应的荧光信号，则检测位点碱基为t，即该样品为携带ms30的纯合不育突变型；靠近纵轴(hex轴，波长533-580nm)，说明只检测到ms30k-f2所含hex荧光序列对应的荧光信号，则检测位点碱基为g，即该样品为不含ms30突变的野生型；靠近第一象限对角线，说明同时检测到两种荧光信号，即该样品为含有ms30的杂合型。
16、根据本发明的编辑番茄ms30基因获得番茄雄性不育突变体的方法，所述方法包括以下步骤：
17、基因编辑靶位点1的序列为5’-tagcttcacaaagaacagta-3’，靶位点2的序列为5’-gttgtttgtgttttctattc-3’，这2个靶位点序列均位于ms30(solyc06g059970)基因的第一个外显子，基于这2个靶位点序列，分别设计了引物crv1-f:
18、5’-ttcatctcgggtctctaaactagcttcacaaagaacagttgaccgttgatagtggatag-3’和crv1-r:用于构建基因编辑载体-1；
19、基因编辑靶位点3的序列为5’-ttctctttgatgatacactt-3’，靶位点4的序列为5’-caatggctcccatctccttt-3’,这2个靶位点序列均位于ms30(solyc06g059970)基因的最后一个外显子，基于这2个靶位点序列，分别设计了引物crv2-f:和crv2-r:用于构建基因编辑载体-2；
20、将基因编辑载体-1和载体-2分别转化农杆菌(agrobacterium tumefaciens)菌株gv3101，然后通过根癌农杆菌介导的子叶外植体转化方法，将上述2个载体分别转入到待编辑的番茄中。
21、筛选阳性转基因植物。
22、根据本发明的具体实施方式，鉴定solyc06g059970基因编辑突变体及序列变异，获得了两个solyc06g059970基因突变体，cr-e1突变体的solyc06g059970基因存在4-bp的缺失，cr-e7的solyc06g059970基因存在66-bp的缺失。观测solyc06g059970基因编辑突变体的表型。cr-e1和cr-e7突变体的雄蕊都表现出卷曲、褶皱、绿色，柱头外露，不能产生花粉，与ms30突变体的表型类似，为番茄雄性不育突变体。
23、cr-e1、cr-e7和ms-30之间的等位测试表明它们是等位突变(表2)。这些结果表明，(1)solyc06g059970是ms30基因；(2)通过基因编辑ms30，可以快速获得雄性不育系。
24、本发明的优点和有益技术效果：
25、番茄雄性不育突变体ms30具有扭曲的雄蕊和外露的柱头，便于直接授粉而不需要人工去雄，可用于杂交种子生产。但是，ms30基因及其序列变异之前没有报道过，无法在育种中快速、精准利用。本发明将ms30位点精细定位到53.3-kb的区间。番茄b类mads-box基因solyc06g059970被确定为ms30候选基因。测序分析揭示了突变体ms30的solyc06g059970基因中存在序列变化。本技术基于该序列变化，开发了一个共显性kasp分子标记ms30k。利用分子标记ms30k，可以快速、准确区分含突变位点ms30的番茄雄性不育突变体、杂合植株和纯合育性正常植株。本发明还对solyc06g059970进行基因编辑，所得突变体的表型与ms30相似，为番茄雄性不育突变体。等位测试表明solyc06g059970基因编辑突变体和ms30是等位突变。因此，确定solyc06g059970是ms30基因。本发明利用分子标记ms30k辅助选择ms30位点或者对ms30基因进行基因编辑，可以快速获得番茄雄性不育材料，提高育种效率。
1.与番茄雄性不育位点ms30共分离的snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记位于番茄solyc06g059970基因编码序列seq id no：1或seq id no：3的第176bp处，多态性为g/t，该碱基为g的番茄可育、该碱基为t的番茄则雄性不育。
2.检测权利要求1中所述的snp的kasp分子标记ms30k的引物组合，其特征在于，所述引物对包括以下引物：
3.一种鉴定番茄雄性不育性状的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：提取待检测番茄样品基因组dna，以基因组dna为模板，采用kasp分子标记ms30k的引物组合进行pcr和荧光检测，其中，所述kasp分子标记ms30k的引物组合包括：
4.一种编辑番茄ms30基因获得番茄雄性不育突变体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的编辑番茄ms30基因获得番茄雄性不育突变体的方法，其特征在于，基于所述基因编辑sgrna靶位点1、基因编辑sgrna靶位点2分别设计引物crv1-f:5’-ttcatctcgggtctctaaactagcttcacaaagaacagttgaccgttgatag tggatag-3’和crv1-r:5’-ttcatctcgggtctcgtttgaatagaaaacacaaacaacgttttagagcta gaaatag-3’，用于构建基因编辑载体-1；
6.权利要求1所述的与番茄雄性不育位点ms30共分离的snp在番茄种质资源鉴定中的应用。
7.权利要求2所述引物组合在番茄种质资源鉴定中的应用。
8.权利要求1所述的与番茄雄性不育位点ms30共分离的snp分子标记在番茄分子标记辅助育种的应用。
9.权利要求2所述引物组合在番茄分子标记辅助育种的应用。
