本发明属于瞬时转染表达蛋白，尤其涉及一种稳转细胞株载体用于瞬时转染表达双特异性抗体的方法。
背景技术：
1、瞬时转染是将外源dna导入真核细胞的一种方式，在瞬时转染中，外源基因进入宿主细胞后不会整合到细胞染色体上，由于具有操作简便且能够快速生产目的蛋白的特点，因此被广泛应用于抗体药物的早期成药性研究阶段的样品制备。
2、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，pei)是目前在工业界瞬时转染表达蛋白使用最广泛的试剂，其原理是带正电的pei能将带负电的dna包裹成带正电的pei-dna复合物，这些复合物可以与带负电荷的细胞表面结合并通过胞吞作用进入细胞。pei相比其它转染试剂有着成本低廉的优势，因此在工业界尤其是大规模生产中被广泛采用。
3、结构较为复杂的由多条不同肽链组成的双特异性抗体，在瞬转阶段通常会将每一条肽链基因单独构建在一个质粒载体上。在瞬转表达目的蛋白时，需要将多种含有不同肽链基因的质粒同时加入到培养体系中进行共转染。在构建稳定转染细胞株前，通常还需要通过瞬转来测试不同质粒的转染比例。在确定最优的转染比例后，通常会重新构建表达载体，并在表达载体上添加筛选基因(如gs基因、抗生素筛选基因等)。对于结构复杂的双抗分子，构建稳转细胞株时为实现多条肽链在一个质粒上的共表达以及共用一个筛选标记基因，通常会在一个载体上添加多个多克隆位点用于多个目的基因整合。以上技术方案的优势在于，可在瞬转阶段对质粒比例进行摸索，为后续构建稳定转染细胞株提供参考。但对于结构相似，仅靶点不同的平台类双抗分子，其最佳的转染比例往往相同，因此，在积累了足够的平台经验后，无需通过瞬转测试来确定后续构建稳定转染细胞株的质粒最佳添加比例。
4、但是，该技术方案的弊端在于：瞬时转染阶段单个载体只含有一种目的基因，对于结构复杂的双特异性抗体，通常需要构建并在转染时添加3-4种不同的质粒，操作繁琐；瞬转阶段将每一个目的基因单独构建在一个载体上，无法实现在一个载体上表达多条肽链以及共用一个筛选标记基因，相比采用稳转细胞株构建的质粒，质粒用量更大，容易对细胞造成损伤；载体构建通常需要1个月左右的时间，瞬转和稳转阶段分别构建不同的载体，在时间和成本上均造成了巨大的浪费。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了解决上述技术问题，而提供稳转细胞株载体用于瞬时转染表达双特异性抗体的方法，从而实现蛋白表达水平得到显著提升。为了达到上述目的，本发明技术方案如下：
2、稳转细胞株载体用于瞬时转染表达双特异性抗体的方法，包括以下步骤：采用的宿主细胞为cho-k1，所用载体为以pcdna3.1为基础构建的含有多个多克隆位点的质粒，表达产物含有三条不同肽链为c1、c2和c3链的双特异性抗体，所构建的质粒分别为质粒1：c1和c2链共表达，质粒2：c2和c3链共表达，质粒上均构建有gs筛选基因；
3、细胞传代与扩增，在摇瓶中进行细胞传代与扩增，细胞于37℃、5％ co2、120rpm摇床中培养，培养基为balancd transfectory cho+4mm谷氨酰胺，转染前一代用培养基调整种子密度，使细胞生长2-3天后在转染时活细胞密度在(2-4)×106cells/ml；
4、取总培养体积10％的新鲜培养基，加入质粒1和质粒2，混匀为质粒溶液；所用质粒表达的目的产物为平台类双抗分子，转染当天所有实验组按照质粒1：质粒2＝2：3(w/w)的比例进行转染；
5、取离心管，加入pei试剂；
6、将质粒溶液加入pei试剂中，混匀并孵育形成dna-pei复合物；将dna-pei复合物加入细胞液中，边滴加边摇晃细胞液；所测试的实验条件为：每毫升培养体积中加入的总质粒量为(0.5-1.5)ug/ml，pei：dna(体积质量比，ul：ug)＝(2-3)：1；
7、将转染后的细胞放回摇床中培养，转染后的培养温度为：37℃、33℃、31℃以及转染24h后降温至33℃培养；于转染后多次进行补料，当细胞活率低于60％时收获，取细胞上清检测抗体表达量。
8、与现有技术相比，本发明稳转细胞株载体用于瞬时转染表达双特异性抗体的方法的有益效果主要体现在：
9、表达产物为由三条不同肽链组成的双特异性抗体，每个载体上含有两个多克隆位点用于共表达两条不同的肽链，通过尝试不同的细胞培养工艺，优化pei用量、质粒用量及培养温度，使蛋白表达水平得到显著提升。
1.稳转细胞株载体用于瞬时转染表达双特异性抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的稳转细胞株载体用于瞬时转染表达双特异性抗体的方法，其特征在于：所测试的实验条件为：每毫升培养体积中加入的总质粒量为0.5ug/ml，pei：dna(体积质量比，ul：ug)＝2：1。
3.根据权利要求1所述的稳转细胞株载体用于瞬时转染表达双特异性抗体的方法，其特征在于：所述转染后的培养温度为：初始37℃，转染24h后降温至33℃培养。
