本发明涉及生物检测技术。更具体地，涉及一种提高萤火虫荧光素酶报告基因检测稳定性的试剂盒及其应用。
背景技术：
1、在科研与应用过程中，当待检测细胞或者生物学过程缺少适宜的指示物，但待检测物的下游表达特异性的转录因子时，可以将转录因子对应的转录相关元件如启动子区dna和报告基因序列一同转入待检测细胞，建立报告基因细胞系。通常报告基因会选择可以被准确检测的荧光蛋白质或酶，检测荧光蛋白表达量或通过检测酶参与的反应产物等作为指示物来反应待测细胞或生物学过程的活性。
2、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)作为一种常见的报告基因所选取的酶，其可以催化底物荧光素(luciferin)进行氧化，在氧化过程中，荧光素底物发出波长在560nm附近的生物荧光，通过荧光测定仪可以精准测定荧光信号值，进而准确定量萤火虫荧光素酶表达量。通过荧光素酶-荧光素这一反应体系可以灵敏高效的测定体系内荧光素酶表达水平，进而反映调控荧光素酶表达的转录因子与荧光素酶启动子区dna结合的相互作用程度，进一步反映上游生物学过程的活性。萤火虫荧光素酶不是胞外分泌蛋白，是一种胞浆蛋白，需要通过细胞裂解将荧光素酶释放出来，再接触到底物发生反应。在荧光素酶-荧光素这一反应过程中，需要氧气进行氧化底物，三磷酸腺苷来提供能量，同时还需要二价金属离子参与到反应中，最后发出可被检测的荧光信号。利用这一反应原理开发出荧光素酶报告基因系统，目前常应用于多种表达元件调控功能的验证实验。如启动子转录活性，转录因子结合位点验证，microrna结合位点验证，5’utr和3’utr功能验证，增强子/沉默子功能验证，效应元件功能验证等。借由此基因表达调控验证相关实验，可以更深入更广泛的运用到抗体药等生物药相关开发与生产质控领域中，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(adcc)作用实验，可实现大规模、高准确性、高效率的生物活性检测，可面向包括科研、生产等诸多侧重方面，具有广阔的应用实景和应用深度。
3、在检测细胞中萤火虫荧光素酶报告基因的表达量时，会遇到检测信号值快速下降的情况，对于多个样品的检测会造成检测前后的不一致性，存在荧光信号稳定性较差，信号半衰期较短的问题。因此，需要能快速、灵敏和准确地检测到荧光信号的荧光素酶报告基因检测试剂，且其能在长时间的检测操作中保持稳定的荧光信号。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种提高萤火虫荧光素酶报告基因检测稳定性的试剂盒，该试剂盒具有高稳定性，发光信号半衰期长，更适应多样品同时检测的性能。
2、本发明的另一个目的在于提供上述试剂盒在提高萤火虫荧光素酶报告基因检测稳定性中和/或抗体药生物活性检测中的应用。
3、为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
4、本发明首先提供了一种提高萤火虫荧光素酶报告基因检测稳定性的试剂盒，所述试剂盒包括缓冲液与检测底物；
5、其中，所述缓冲液包括蔗糖、三羟甲基氨基甲烷、甘油、表面活性剂、离子螯合剂、二价金属离子、三磷酸腺苷、还原剂和辅酶a；所述检测底物包括荧光素。
6、在本发明中对萤火虫荧光素酶报告基因检测需要缓冲液与检测底物共同加入，缓冲液提供反应的环境，检测底物提供荧光素，萤火虫萤光素酶催化氧化荧光素，发出可被检测的荧光，具体反应式如下：
7、
8、进一步，所述蔗糖在缓冲液中的浓度为10mm-50mm，优选为50mm。
9、进一步，所述三羟甲基氨基甲烷在缓冲液中的浓度为50mm-200mm，优选为150mm。
10、进一步，所述甘油在缓冲液中的浓度为1％-20％，优选为20％。
11、进一步，所述表面活性剂为吐温20和曲拉通100中任意一种，优选为吐温20，在缓冲液中的浓度为1％-10％，优选为5％。
12、进一步，所述离子螯合剂为乙二胺四乙酸、1,2-环己二胺四乙酸、氨基三乙酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸中任意一种，优选为乙二醇二乙醚二胺四乙酸，在缓冲液中的浓度为5mm-20mm，优选为6mm。
13、进一步，所述二价金属离子为ca2+、mn2+、mg2+、zn2+、cu2+中任意一种，优选为mg2+，在缓冲液中的浓度为5mm-15mm，优选为8mm。
14、进一步，所述三磷酸腺苷在缓冲液中的浓度为0.01mm-1mm，优选为0.05mm。
15、进一步，所述还原剂为二硫苏糖醇，在缓冲液中的浓度为1mm-20mm，优选为2mm。
16、进一步，所述辅酶a在缓冲液中的浓度为0.01mm-0.1mm，优选为0.03mm。
17、进一步，所述荧光素为d-荧光素，所述d-荧光素溶解在缓冲液中进行检测时的浓度为4mm-10mm，优选为6mm。
18、上述试剂盒在如下任一所述的应用也在本发明的保护范围之内：
19、1)在提高萤火虫荧光素酶报告基因检测稳定性中的应用；
20、2)在抗体药的adcc体系生物活性检测中的应用。
21、本发明中抗体药的adcc体系生物活性检测是通过萤火虫荧光素酶报告基因检测实现的。在本发明具体的实施方式中，所述抗体药的adcc体系生物活性检测方法包括如下步骤：
22、将靶细胞、抗体药以及效应细胞进行铺板，孵育，得到待检测细胞样品培养板；
23、将上述试剂盒中缓冲液进行溶解并平衡至室温，颠倒混匀后加于检测底物中，颠倒混匀彻底溶解检测底物，得到检测液；将待检测细胞样品培养板平衡至室温，加入与待检测细胞样品相同体积的检测液，震荡，彻底裂解细胞，使用带有化学发光检测模块的酶标仪测量发光信号值。
24、在本发明优选的实施方式中，所述抗体药的adcc体系生物活性检测方法包括如下步骤：
25、1)构建模拟效应细胞
26、构建表达fcγiiia(v158)和nfat-luc报告基因的jurkat细胞，即效应细胞fcγiiia(v158)-luci jurkat；
27、2)细胞铺板与孵育
28、将靶细胞、抗体药以及模拟效应细胞以合适的比例进行铺板，其中，raji细胞(靶细胞)为8e5个/孔，模拟效应细胞fcγiiia(v158)-luci jurkat为2e5个/孔，抗体药(利妥昔单抗)浓度为0.00005μg/ml，0.0001μg/ml，0.0005μg/ml，0.001μg/ml，0.005μg/ml，0.01μg/ml，0.05μg/ml，0.1μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，2.5μg/ml，整体孵育体积为100μl/孔，于96孔板中孵育6小时，得到待检测细胞样品培养板。
29、3)萤火虫荧光素酶报告基因检测
30、将上述试剂盒中缓冲液在室温进行溶解并平衡至室温，轻摇颠倒混匀后加于检测底物中，颠倒混匀彻底溶解检测底物，得到检测液；
31、将待检测细胞样品培养板平衡至室温，加入与待检测细胞样品相同体积的检测液，水平摇床上震荡3分钟，彻底裂解细胞，使用带有化学发光检测模块的酶标仪测量发光信号值。
32、本发明的有益效果如下：
33、1、本发明提高萤火虫荧光素酶报告基因检测稳定性的试剂盒检测到的发光信号值的半衰期比同类产品可检测到的发光信号值的半衰期更长，对于某些样品数量较多的检测，可维持较稳定的信号值，能完美的进行平行检测，检测结果更准确和稳定。
34、2、本发明提高萤火虫荧光素酶报告基因检测稳定性的试剂盒实现一步法检测荧光素酶报告基因，直接在待检测样品中加入检测试剂，避免了繁琐的收集细胞等操作步骤，更简捷，更快速，适应多样品的高通量检测需求。
35、3、本发明提高萤火虫荧光素酶报告基因检测稳定性的试剂盒适用于常规的多种表达元件调控功能的验证实验以及多种生物活性检测，适应范围广，例如制药企业研发和生产质控中抗体药的adcc等生物活性检测、假病毒检测以及创新药研发等实验。
1.一种提高萤火虫荧光素酶报告基因检测稳定性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括缓冲液与检测底物；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蔗糖在缓冲液中的浓度为10mm-50mm，优选为50mm。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷在缓冲液中的浓度为50mm-200mm，优选为150mm；
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20和曲拉通100中任意一种，优选为吐温20；
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述离子螯合剂为乙二胺四乙酸、1,2-环己二胺四乙酸、氨基三乙酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸中任意一种，优选为乙二醇二乙醚二胺四乙酸；
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述二价金属离子为ca2+、mn2+、mg2+、zn2+、cu2+中任意一种，优选为mg2+；
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述还原剂为二硫苏糖醇；
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光素为d-荧光素；
9.权利要求1-8任一所述的试剂盒在如下任一所述的应用：
10.一种抗体药的生物活性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
