本发明涉及抗病种质资源评价领域，具体涉及一种耐黄龙病柑橘资源的精细评价鉴定方法。
背景技术：
1、我国是全球柑橘生产第一大国，面积和产量均居世界第一。然而，柑橘黄龙病的爆发对柑橘产业的发展造成了毁灭性打击。目前，柑橘黄龙病在我国南方各省以及全球几乎所有柑橘主产区日趋严重，造成大面积柑橘园减产、低质甚至绝收、毁园，对柑橘产业发展造成了重大损失。据估计，黄龙病已造成全球上亿株柑橘树染病或者死亡。在国内，19个栽培柑橘的省区已有11个遭受到柑橘黄龙病危害，受灾面积已达栽培总面积的80％，损失产量达总产量的85％左右。柑橘黄龙病已成为世界范围内防治最难、危害最重、威胁最大的一种毁灭性病害。
2、柑橘黄龙病病原菌(candidatus liberibacter asiaticus)是一种革兰氏阴性细菌，能够侵染几乎所有的柑橘及其近缘属植物，该病菌目前无法分离培养，尚无有效防治柑橘黄龙病的方法。柑橘树体感染黄龙病菌之后，会导致叶片黄化、皱缩，果实着色异常、畸形，病根表皮易脱离、腐烂，树体生长受阻直至死亡。
3、柑橘黄龙病是一个世界性难题，主要缘于黄龙病菌不能离体培养和没有抗性种源。黄龙病菌不能离体接种对于种质资源抗性鉴定与评价以及致病机理研究带来了巨大挑战。同时黄龙病潜伏期长，同一棵树在不同组织部位、不同季节病原菌的浓度都有明显的波动，也为抗性评价与鉴定带来了困难。自1919年黄龙病首次被报道至今，研究人员对柑橘及其近缘种对黄龙病的抗性或耐受性进行了大量的调查和接种实验，但是很多报道的结果并不一致，主要是由于缺乏系统稳定的评价方法。
4、目前对于柑橘耐病性的鉴定主要通过带毒砧木的嫁接，检测接穗的病菌含量和生长状况来评价不同品种的耐病能力。检测时间则在接种后三个月至一年不等，由于接种时间不长，可能导致耐病表型不准确，对评价结果有显著影响。
5、目前为止，尚没有高效、稳定的耐黄龙病柑橘资源筛选评价方法，也没有可用于培育耐黄龙病柑橘新品种的耐病资源。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种耐黄龙病柑橘资源的精细评价鉴定方法。本发明通过三种不同的接种方法给待评价种质资源接种黄龙病，并结合黄龙病病菌定量pcr检测。三种方法同步应用，能够保证接种的稳定性和可靠性，提高鉴定准确性，具有准确、稳定、高效等优点。
2、为实现上述目的，本发明所设计的技术方案如下：
3、本发明提供了一种耐黄龙病柑橘资源的精细评价鉴定方法，包括以下步骤：
4、1)将待评价柑橘资源分成三份，分别使用以下三种方法接种黄龙病菌
5、a.染病大树做砧木高接接种黄龙病菌，
6、b.木虱媒介接种黄龙病菌，
7、c.带菌接穗嫁接接种黄龙病菌；
8、2)发病症状观察：在步骤1)中三种方法接种黄龙病菌的待评价柑橘资源在接种3个月后开始每月定期观察，根据待评价柑橘资源抽出的新稍的症状来诊断：
9、a.3种方法接种后持续12个月枝梢生长健壮、无黄梢黄叶，则初步判定该种质资源对黄龙病具有抗性或耐性；
10、b.3种方法接种后均表现出枝梢长势弱、有黄梢、叶片斑驳黄化症状明显，则判定该种质资源易感柑橘黄龙病；
11、3)病原菌含量检测：根据步骤2)初步判定，采集具有抗性或耐性的待评价柑橘资源的叶片，提取dna，通过taqman探针法定量pcr检测含菌量(同时使用健康柑橘叶片dna作为阴性对照，确定感染黄龙病菌的柑橘叶片dna作为阳性对照)；
12、4)结果评价：根据上述步骤taqman探针法定量pcr检测含菌量结果，结合步骤3)发病症状观察结果进行综合评价：
13、当通过三种方法接种的待评价资源均检测不到黄龙病菌且植株生长状态良好，无黄龙病症状时，则判定该种质资源抗黄龙病；
14、或者，当通过三种方法接种的待评价资源检测到黄龙病菌且黄龙病菌含量均很低，即ct>30，而且植株生长状态良好，无黄龙病症状时，则判定该种质资源高度耐黄龙病；
15、或者，当步骤a的方法接种的待评价资源检测到黄龙病菌且黄龙病菌含量很高，即ct<30；且步骤b和步骤c的方法接种的待评价资源均植株生长状态良好，无黄龙病症状且黄龙病菌含量均很低，即ct>30时，则判定该种质资源中度耐黄龙病；
16、或者，当三种方法或任意两种方法接种的待评价资源检测到黄龙病菌且黄龙病菌含量都很高，即ct<30时，则判定该种质资源不耐黄龙病。
17、进一步地，所述步骤4)中，定量pcr过程中，使用黄龙病菌16s rrna基因特异引物hlb和探针hlbp检测病原菌ct hlb，使用柑橘线粒体基因细胞色素氧化酶cox基因特异引物cox-f和探针coxp作为内参来校正dna的浓度ct cox；最终ct值计算公式为：
18、ct＝ct hlb+(18-ct cox)；其中，
19、ct hlb表示黄龙病菌16s rrna基因特异引物hlb检测的ct值，
20、ct cox表示柑橘线粒体基因细胞色素氧化酶cox基因特异引物cox检测的ct值，
21、上述引物和探针序列为：
22、hlb-f：5′-tcgagcgcgtatgcgaatacg-3′
23、hlb-r：5′-gcgttatcccgtagaaaaaggtag-3′
24、cox-f：5′-gtatgccacgtcgcattccaga-3′
25、cox-r：5′-gccaaaactgctaagggcattc-3′
26、hlbp：5′-agacgggtgagtaacgcg-3′
27、coxp：5′-atccagatgcttacgctgg-3′
28、其中，hlbp和coxp为探针序列，5′端用报告荧光基团羧基荧光素fam修饰，3′端用淬灭荧光基团bhq1修饰。
29、再进一步地，所述步骤2)中，染病大树做砧木高接接种黄龙病菌的方法如下：
30、a1.在感染黄龙病果园选取和待评价资源嫁接亲和性好(选取的砧木和待评价资源嫁的接穗材料嫁接亲和，能够嫁接成活)且感染黄龙病菌的柑橘成年树，经探针定量pcr检测确定带菌后，作为高接树；
31、a2.利用单芽切接的方式将1份的待评价柑橘资源枝条上的单芽嫁接到高接树上(每棵带菌高接树可同时嫁接多份待评价资源)且每份待评价柑橘资源枝条需嫁接在多株高接树上，嫁接成活后保持常规的果园田间管理，嫁接未成活的及时补接，嫁接的待评价资源的单芽萌发抽稍后，持续观察并采样检测。
32、再进一步地，所述步骤2)中，木虱媒介接种黄龙病菌的方法如下：
33、b1.将健康的两年生待评价柑橘资源实生苗或嫁接苗(株高约60-100cm)种植在的育苗钵中，连同育苗钵一起放入防虫网罩内(一个防虫网罩内放一棵待评价资源)，
34、b2.从感染黄龙病的柑橘果园抓取柑橘木虱(即为柑橘木虱成虫)，检测确保柑橘木虱的带菌量在50％以上，然后将带菌柑橘木虱投放到放有待评价资源的防虫网罩内(每个防虫网罩内投放100头柑橘木虱)，让其在待评价资源上取食；当柑橘木虱在待评价柑橘资源上取食15天后，将柑橘木虱全部取出杀灭，防虫网罩内的待评价柑橘资源继续保持正常的水、肥、病虫害管理，持续观察感病状态并采样检测。
35、再进一步地，所述防虫网罩由防虫网制作的长方体全封闭防虫网罩且防虫网罩的一个侧面开口缝制有一条方便打开的拉链
36、再进一步地，所述防虫网的目数为60目；所述防虫网罩的长宽高分别为20cm、20cm和120cm。
37、再进一步地，所述步骤2)中，带菌接穗嫁接接种黄龙病菌的方法如下：
38、从感染黄龙病的树上取饱满成熟的枝条，通过探针定量pcr检测确定带菌后作为接穗，通过嵌芽接的方式嫁接到两年生的待评价柑橘资源实生苗或嫁接苗(即为带菌苗)上，从根颈以上15cm处开始，间隔嫁接带菌芽(间隔嫁接一个单菌芽，且每棵苗上嫁接带菌芽的数量为3～6个)，嫁接成活后保持正常的水、肥、病虫害管理，嫁接未成活的及时补接，持续观察感病状态并采样检测。
39、本发明的有益效果：
40、1.本发明通过综合多种接种方法鉴定耐黄龙病柑橘资源，为柑橘资源的筛选和选育提供科学依据。
41、2.本发明三种接种方法的优点：
42、i.染病大树做砧木高接接种可以加速柑橘耐病性评价的进程，接菌量大，接种效率高，节省时间和人力成本，适用于大规模资源初筛；
43、ii.木虱媒介接种接近于田间病菌自然传播过程，排除其它客观因素干扰，接种评价真实可靠；
44、iii.病原接穗嫁接接种，接种过程持续稳定。
45、本发明将三种方法相结合，能够保证评价结果的准确性和稳定性。
46、3.本发明对于耐黄龙病柑橘资源的发掘鉴定工作具有积极的推动作用。
1.一种耐黄龙病柑橘资源的精细评价鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述耐黄龙病柑橘资源的精细评价鉴定方法，其特征在于：所述步骤4)中，定量pcr过程中，使用黄龙病菌16s rrna基因特异引物hlb和探针hlbp检测病原菌cthlb，使用柑橘线粒体基因细胞色素氧化酶cox基因特异引物cox和探针coxp作为内参来校正dna的浓度ct cox；最终ct值计算公式为：
3.根据权利要求1所述耐黄龙病柑橘资源的精细评价鉴定方法，其特征在于：所述步骤2)中，染病大树做砧木高接接种黄龙病菌的方法如下：
4.根据权利要求1所述耐黄龙病柑橘资源的精细评价鉴定方法，其特征在于：所述步骤2)中，木虱媒介接种黄龙病菌的方法如下：
5.根据权利要求4所述耐黄龙病柑橘资源的精细评价鉴定方法，其特征在于：所述防虫网罩由防虫网制作的长方体全封闭防虫网罩且防虫网罩的一个侧面开口缝制有一条方便打开的拉链。
6.根据权利要求5所述耐黄龙病柑橘资源的精细评价鉴定方法，其特征在于：所述防虫网的目数为60目；所述防虫网罩的长宽高分别为20cm、20cm和120cm。
7.根据权利要求1所述耐黄龙病柑橘资源的精细评价鉴定方法，其特征在于：所述步骤2)中，带菌接穗嫁接接种黄龙病菌的方法如下：
